Puesta a punto del paralelo Columna de flujo segmentado y habilitación de detección de multiplexado

Summary

Here, we present a protocol for the operation and tuning of parallel segmented flow chromatography columns to enable multiplexed detection.

Abstract

Active flow technology (AFT) is new form of column technology that was designed to overcome flow heterogeneity to increase separation performance in terms of efficiency and sensitivity and to enable multiplexed detection. This form of AFT uses a parallel segmented flow (PSF) column. A PSF column outlet end-fitting consists of 2 or 4 ports, which can be multiplexed to connect up to 4 detectors. The PSF column not only allows a platform for multiplexed detection but also the combination of both destructive and non-destructive detectors, without additional dead volume tubing, simultaneously. The amount of flow through each port can also be adjusted through pressure management to suit the requirements of a specific detector(s). To achieve multiplexed detection using a PSF column there are a number of parameters which can be controlled to ensure optimal separation performance and quality of results; that is tube dimensions for each port, choice of port for each type of detector and flow adjustment. This protocol is intended to show how to use and tune a PSF column functioning in a multiplexed mode of detection.

Introduction

Columnas Tecnología Flow Activo

Tecnología de flujo activo (AFT) columnas de cromatografía fueron desarrollados recientemente para superar la ineficiencia en las separaciones asociados a la heterogeneidad del flujo ^1-6 y también para permitir la detección de multiplexado. En esta comunicación detalle que en particular el proceso operativo del paralelo segmentado flujo (PSF) columna con detección de multiplexado. Las ventajas funcionales clave de la columna de la PSF son: (1) el flujo desde la región central radial del lecho de la columna está aislada de la región periférica o la pared del flujo, (2) el volumen de fase móvil que debe ser procesada por una detección fuente se reduce, y las fuentes (3) de detección puede ser multiplexada para expandir información de la muestra sin infundir retrasos de detección a través de cada proceso de detección, o posteriormente que requiere la división de una corriente de flujo post-columna ^7,8. La característica clave en el diseño de la columna de fibras discontinuas de poliéster que permite que la unaVentaja de la detección multiplexada es la novela de salida montaje de empalme y frita. La figura 1 es una fotografía de la columna AFT en comparación con una columna convencional. Es importante entender que el proceso de división obtuvo utilizando columnas de flujo segmentado paralelo no es la misma que la división de corriente de flujo post-columna. En una corriente de flujo post-columna dividir toda la banda de muestra desde el borde de ataque a las extremidades de la cola es igualmente incluidos en la muestra (es decir, axialmente), de ese modo, cada corriente de flujo es igual con respecto a la eficiencia y sensibilidad; la magnitud de la sensibilidad de este modo se divide por las divisiones de números. En PSF, sin embargo, las muestras de proceso de división de la banda radialmente, no axialmente. Como tal, las muestras de puertos centrales del vértice del pico – la región más concentrada del pico. Por lo tanto, la sensibilidad es más alta aquí como el pico no se diluye por la región difusa tizón. La muestra se eluye de los puertos periféricos no es tan eficiente como en el Centrazona l, pero, ya que la banda se muestrea radialmente, en lugar de axialmente, la anchura del pico es más estrecha que sería el caso para un proceso de muestreo que divide el pico en la dirección axial, es decir, una fracción de post-columna. Por lo tanto la sensibilidad de un detector dependiente de la concentración no se reduce.

En la columna de la PSF, el racor de salida comprende múltiples puertos de salida y en el interior de esta final apropiado se aloja una frita anular. La porción interior de este anulares canales de frita fluya hacia fuera de la columna a través del puerto de salida radial central, mientras que la porción radial exterior de los canales de frita de salida fluya hacia fuera de la columna a través de los puertos de flujo de salida periféricas o región de la pared. Las porciones interior y exterior de la frita de salida están separados por una barrera impermeable que impide el flujo transversal entre estas regiones de flujo ^2. Como consecuencia de este diseño, la corriente de flujo radial central a través del lecho de la columna se separa de los ins de flujo región de paredide la columna. La porción relativa de flujo de estas dos regiones puede ser variada para casi cualquier relación deseada mediante la gestión de la presión con el fin de optimizar varios aspectos funcionales de la tecnología de la columna, como la eficiencia de separación o sensibilidad de detección. En esencia, este diseño establece con eficacia dentro de la columna de la mayor formato de una columna "virtual", que tiene un diámetro interno más estrecho, y por lo tanto las funciones de columna como una columna verdadera pared de menos, la superación de la columna heterogeneidad de cama y los efectos de pared ^9,10.

Los principales beneficios de columnas PSF son mejoras en la eficiencia de la columna, la minimización del procesamiento disolvente para la fuente (s) de detección y que permite la detección multiplexada. Sin embargo, una ventaja añadida es que desde el tizón y regiones al frente de cualquier banda se eliminan de la elución global perfil del soluto en la elución o detección está presente en una concentración mayor que de lo contrario se observa para los mismos solute inyección y la carga de la concentración en una columna convencional, dependiendo de la relación de segmentación empleada. Como consecuencia de ello, se observa a menudo una ganancia en la intensidad de la señal para separaciones realizadas en columnas PSF ^2. De hecho, si la relación de segmentación se ajusta de tal manera que 25% de las salidas de flujo de cada uno de los cuatro puertos de salida, la intensidad de la señal que se observa usando violeta (UV) de detección Ultra muestra prácticamente la misma intensidad de la señal exacta como aparente utilizando una convencional columna donde se analiza la totalidad (100%) de la fase móvil ^7. Por otra parte, el ajuste fino de la relación entre la toma de las regiones del centro y de la pared de flujo permite que la eficiencia de la columna que se ha optimizado. Las ganancias en eficiencia de la columna observaron utilizando columnas AFT no se puede afirmar a un solo valor, ya que estos aumentos de la eficiencia son una función de tres factores: (1) la velocidad de flujo, (2) la relación de segmentación, y (3) el factor de retención de soluto . Sin embargo, las ganancias en eficiencia en comparación con convcolumnas entional casi siempre se observaron, y, a veces estas ganancias son más de 100% en el número de platos teóricos ^1,2. La capacidad de ajustar la relación de segmentación permite que el analista para adaptar efectivamente el diámetro de la columna "virtual", y esto es un factor importante en relación con el proceso de detección. Por ejemplo, un 2,1 mm de diámetro (id) la columna virtual interna se establece a partir de una columna ID física 4,6 mm cuando la relación de segmentación es 21% de la fase móvil, eluyendo desde el puerto de salida radial central. En estas condiciones, la columna ID de 2,1 mm virtual realiza con una eficiencia que puede ser más de 70% mayor que la columna ID de 2,1 mm convencional, dependiendo de la tasa de flujo, y el factor de retención de soluto ^10.

El diseño de la columna PSF actual que se utiliza para la detección multiplexada incorpora un 4-puerto de salida apropiado, pero la columna se puede equipar con un 2-puerto de herraje final también, sin embargo, esto limita la detección to sólo dos detectores. El funcionamiento básico de estas columnas es, sin embargo, la misma, excepto que los cuatro detectores se pueden acoplar simultáneamente a la columna de fibras discontinuas de poliéster de 4 orificio de salida de ampliar el alcance para la detección multiplexada. Aparte de tubo conectivo columna antes y después, los únicos requisitos adicionales para operar una columna de fibras discontinuas de poliéster se tubería que se puede conectar a los puertos de salida periféricos, y un medio por el cual la cantidad de fase móvil pasa a través de cada tubo se puede medir, típicamente una medición de la masa o una medición volumétrica. Para facilitar la afinación, el diámetro interno de todos los tubos de flujo de salida debe ser el mismo. La relación de flujo entre los puertos de salida centrales periféricas y radiales se varía entonces a través de la utilización de gestión de la presión, simplemente cambiando la longitud de la tubería se encuentra en la salida periférica ajustada, o la longitud del detector de post tubo en el puerto radial salida central.

Detección multiplexado utilizando columnas PSF </strong>

Una ventaja importante de columnas PSF es que cada uno de los puertos de salida de salida se puede conectar directamente a una fuente de detección, permitiendo así la detección multiplexada. En un sistema de detección bien diseñado un solo análisis con detección multiplexada puede proporcionar información sustancial en lo que respecta a la naturaleza de los componentes dentro de la muestra. Es importante destacar que, ensayos destructivos y no destructivos pueden llevarse a cabo exactamente en el mismo momento, sin retardo de detección. Esto permite la asignación absoluta de, por ejemplo, anti-oxidantes utilizando DPPH ^• reactivo, con componentes observaron para eluir con UV y / o espectrometría de masas (MS) las respuestas de detección de ^7,11. Por lo tanto, cuatro detectores independientes pueden ser operados simultáneamente con porciones apropiadas de flujo dirigido a cada detector a través de cualquiera de los cuatro puertos de salida. Puesto que el flujo a través de estos puertos se puede ajustar fácilmente la cantidad de soluto de alcanzar cualquiera de los detectores se pueden ajustar para adaptarsela sensibilidad del detector de fuente dada. Cabe señalar, sin embargo, que la migración de soluto más eficiente se observa a través del puerto de salida radial central. Cada uno de los puertos periféricos ofrecen eficiencia de separación equivalente, que cuando se establece en 25% a través de cada puerto, es sólo ligeramente menos eficiente que una columna convencional. Como tal, es importante que el detector cuantitativo configurarse para analizar la muestra desde el puerto de salida radial central.

Cuando la creación de una columna de fibras discontinuas de poliéster con el propósito de detección de multiplexado hay un número de consideraciones que deben hacerse para lograr resultados eficientes y de alta calidad; es decir dimensiones de los tubos para cada puerto, la elección de qué puerto para un tipo de detector y el ajuste de flujo.

Tubo Dimensiones para cada puerto

En la cromatografía de la longitud del tubo de la columna posterior juega un papel crucial en la eficiencia y el rendimiento de la separación. Gran dead-volumen como resultado de un largo o ancho tubo de salida de la columna ID de detector se traducirá en una pérdida de eficiencia, resolución y sensibilidad. Por lo tanto, las dimensiones de tubos apropiados deben ser utilizados al configurar la columna de la PSF para alcanzar el máximo potencial en el suministro de separación eficiente al tiempo que proporciona los beneficios de multiplexación.

Puerto de detector

La figura 2 es una ilustración de una configuración de ejemplo de detección de multiplexado (Violet-Visible Ultra (U-Vis), espectrómetro de masas (MS) y 2,2-difenil-1-picrilhidrazil (DPPH ^•) de detección). La ilustración muestra el puerto central está unido al detector MS, mientras que el DPPH ^• y detectores de UV-Vis se adjuntan a los puertos periféricos. Puesto que la MS es el detector más sensible de los tres, fluir a este detector fue dirigido desde el orificio de salida central. Como DPPH ^{• Detección} es selectivo a la presence de antioxidantes, y la menos sensible y más tolerante al ensanchamiento de las bandas, el flujo a este detector fue dirigido desde un puerto periférico. El UV-Vis era un detector secundario "genérico", por lo que fluya a este detector fue dirigido desde un segundo puerto de periféricos.

Ajuste de Flujo

Una vez que el tubo apropiado se ha unido desde un puerto de detector, el flujo que sale de cada uno de los detectores se puede ajustar a la cantidad requerida. Una forma sencilla de medir la cantidad de la salida de cada detector de flujo es pesar la cantidad de fase móvil que eluye a través de cada puerto durante un período determinado de tiempo. El flujo de porcentaje de este modo se puede determinar, y las relaciones de flujo se puede ajustar por cualquiera acortando o alargando el tubo conectado a la línea de toma de corriente de los detectores en consecuencia para adaptarse a los requisitos de los detectores de elección. Diferentes detectores tienen diferentes requisitos de flujo, por ejemplo, la celda de flujo deun detector de fluorescencia (FLD) no es la tasa de flujo limitada, pero se debe tener cuidado para evitar la sobre-presurización de la celda de flujo. Por lo tanto el control de flujo a través del FLD generalmente se logra mediante el ajuste de la caída de presión a través de los otros detectores y el resto del flujo entonces pasa a través de la FLD. Un detector que es sensible a la cantidad de flujo que se entrega es la MS. Generalmente, espectrómetros de masas actuales de gama alta pueden procesar fácilmente alrededor de 1 a 1,5 ml / min de fase móvil acuosa moderadamente. Por encima de esta velocidad de flujo, inundación de la fuente puede hacer que los MS inoperable. Sin embargo, la sensibilidad de detección en la mayoría de los espectrómetros de masas se benefició con caudales inferiores; por lo tanto, la capacidad de división de flujo PSF son extremadamente útiles para aplicaciones que implican la detección MS. Caudales volumétricos de alta de la columna se pueden utilizar, pero con cargas de bajo volumen transportado al detector MS. Afinación del flujo al detector MS, sin embargo, se debe hacer mediante el ajuste de la caída de presión antes de laDetector de MS, en lugar de colocar la EM. Aquí, el uso de mangueras de diámetro interior estrecho (0,1 mm id) es muy útil, ya que la presión se puede ajustar fácilmente sin añadir volumen muerto apropiado.

Dependiendo del tipo de detector el ajuste de la relación de segmentación puede hacerse detector ya sea pre o post. Si un detector no destructivo, como se usa UV-Vis, el porcentaje de flujo sería medido y ajustado detector de correos. Si un solo detector destructiva se utiliza en el multiplex establecer el porcentaje de flujo se determina por el cálculo de la espalda con respecto a otros porcentajes de flujo de puerto. Si un detector basado reactivo se utiliza como DPPH ^•, el porcentaje de flujo se mide detector puesto de trabajo sin la adición de reactivo; y si se utilizan dos o más destructivas detectores, entonces la relación de flujo se mide pre-detector. Sistemas que pueden requerir instrumentación adicional, tales DPPH ^• Detección, tendrá la presión del sistema adicional que puede alterar el flujoporcentaje una vez conectado al sistema de detección. Por lo tanto, la consideración cuidadosa se debe prestar a la presión del sistema de un detector destructiva, al ajustar el porcentaje de flujo pre-detector. Independientemente de la relación de flujo que se establece a través de cualquiera de los puertos, la información cuantitativa se debe obtener mediante la normalización adecuada. Una vez que las relaciones de flujo se establecen, sin embargo, son robustos, y no cambian incluso bajo condiciones de elución de gradiente de ^7,

El protocolo de vídeo detallado que acompaña este manuscrito tiene la intención de mostrar cómo usar y ajustar un funcionamiento columna de fibras discontinuas de poliéster en un modo multiplexado de detección.

Protocol

Nota: Este protocolo contiene instrucciones sobre cómo utilizar una columna de fibras discontinuas de poliéster en un sistema HPLC junto con múltiples detectores para la detección de multiplexado. El protocolo se ha escrito asumiendo que el lector tiene conocimientos básicos y experiencia en cromatografía y diversos métodos de detección de HPLC. Precaución: Por favor, consulte las hojas de datos de seguridad de materiales (MSDS) para todos los materiales y los reactivos antes de su …

Representative Results

Un análisis de HPLC multiplexada se llevó a cabo utilizando una columna de AFT en el modo de PSF (Figura 1) y configurar como se ilustra en la Figura 2. Este tipo de configuración permite una muestra de café que va a analizarse simultáneamente usando UV-Vis, DPPH • y MS en total Contador de Ion modo (TIC). Los compuestos de la muestra de café que respondió a DPPH • podrían entonces ser fácilmente emparejados a los UV-Vis y MS – respues…

Discussion

Este estudio consiste en la caracterización y perfiles de café usando HPLC con detección multiplexado empleando una columna paralela flujo segmentado (PSF). Multiplexado HPLC utilizando columnas de PSF permite la caracterización y la identificación de entidades químicas clave mediante la reducción de la complejidad de los datos de la muestra, mientras que la obtención de un mayor grado de información molécula específica dentro de una fracción del tiempo que tarda el uso de procesos convencionales multi-detec…

Materials

HPLC instrument			Multiple detectors of choice for multiplexed detection. Detectors of choice may require additional instrumentation i.e. pump.
Parallel Segmented Flow HPLC column	Thermo Fisher Scientific	Not Defined	Soon to be commercialised
Methanol	Any brand		HPLC Grade
PEEK tubing	Any brand		Various lengths and i.d.
Column stoppers	Any brand		For blocking unused peripheral ports.
PEEK tube cutter	Any brand
Analytical Scale Balance	Any brand
Stop watch	Any brand
Eluent collection vessels	Any brand		1-2 mL Sample vials can be used as eluent collection vessels