コンピュータ断層撮影法と頭蓋骨自家移植と同種移植片の統合を評価するために、骨形成、血管新生のカップリングの光イメージング
Summary
自家および同種骨移植片の移植は、主要な頭蓋顔面骨損失を治療するための受け入れられたアプローチを構成します。まだ血管新生、細胞分化及び骨形成の間で相互にグラフト組成物の効果は不明です。我々は、移植片近傍での血管新生骨形成の相互依存を解明することを目的としたマルチモーダルイメージングのプロトコルを提示します。
Abstract
骨移植手順の成功を決定する主要なパラメータは、移植片の周囲の血管新生です。我々は、骨自家移植片の移植が豊富な血管形成によってより大きな骨再生を誘導するという仮説を立てました。欠損部位での血管新生に対する移植片の効果を調べるために、我々は、新たに重合し、造影剤を用いた動物の全身潅流を伴う血管形成特徴付けるマイクロコンピュータ断層撮影（μCT）アプローチを開発しました。この方法は、その全体の臓器の詳細な血管解析を可能にします。加えて、血液灌流は、血液由来の蛍光剤の蛍光イメージング（FLI）を用いて評価しました。骨形成は、ヒドロキシアパタイト標的化プローブおよびμCT分析を用いてFLIにより定量しました。幹細胞の動員は、オステオカルシンプロモーターの制御下でルシフェラーゼを発現するトランスジェニックマウスの生物発光イメージング（BLI）によりモニターしました。ここでは、説明し、同種移植片の準備、頭蓋冠の欠陥手術、血管新生の研究と骨（造影剤の in vivo灌流を含む）の形成分析、およびデータ分析のためのプロトコルのμCTスキャンプロトコルを示しています。
血管系の3次元高分解能分析は、特に細動脈の形成に関して、移植された自家移植片を有する動物において有意に高い血管形成を示しました。したがって、血液灌流は、手術後7 日目により自家群で有意に高かったです。私たちは優れた骨の石灰化を観察し、自家移植を受けた動物においてより大きな骨形成を測定しました。自家移植は、細胞が7 番目と10 番目の術後日の骨形成細胞に分化し、移植片-宿主骨の縫合糸に常駐幹細胞の動員を誘導しました。この知見は、強化された骨形成は、に起因し得ることを意味自家移植を特徴付ける増強血管給。図示の方法はしっかり有界骨形成及び新血管形成の点で骨再生を研究するための最適なツールとして機能することができます。
Introduction
外傷、腫瘍切除、減圧性開頭、先天性欠損に頭蓋顔面骨損失はほとんど自身で癒していないと明らかに満たされていない臨床上の必要性を提示します。自家骨移植片及び同種骨移植は、広くこれらの条件1を治療するために使用されます 。
それは広く、骨形成がしっかりと血管新生2,3に連結されていることが認められています。このように、骨再生のための提案された治療法の完全な研究は、全体の欠陥サイト全体に形成する血管樹の総合的な調査を含むべきです。研究モデルで血管新生を特徴づけるいくつかの利用可能な方法があります。血管樹は、組織学的分析によって調べることができます。組織学は、組織を切片に依存するので、結果として得られる画像は歪められる可能性が高いです。この問題に対処するために、生体内顕微鏡画像無傷血管4に対して行うことができます。しかしながら、この方法は一面の画像に限定されます。造影剤で灌流された動物から得た試料のμCTスキャンは、再生部位5を供給する血管網の3Dイメージングを可能にします。このアプローチは、全体として、臓器の血管系の非常に詳細なデモンストレーションのほか、血管分布の綿密な分析を可能にします。さらに、μCTは、血管の異なるサブタイプを特徴付ける血管の様々な直径との間の区別を可能にします。
私たちは、頭蓋冠自家移植片の移植は、同種移植片の移植よりも大きな血管新生を誘導し、この増加した血管新生は、我々は、様々な技術を採用し、この仮説を追求formation.To強化骨に、順番に、つながるという仮説を立てました。我々は、μCTベースの分析を実行することによって、新たに形成された血管樹のパターンを調べました。我々は、血液プールの蛍光プローブを用いて、血液灌流を測定しました。次に、ロバハイドロキシアパタイト指向プローブとμCT分析のFLIにより骨組織の石灰化をsedの。最後に、我々はルシフェラーゼオステオカルシン陽性細胞中で発現させたトランスジェニックマウスにおいてBLIを行い、幹細胞の動員および分化をモニターしました。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここで説明したマルチモーダルイメージングのアプローチの目的は、頭蓋骨移植の文脈における血管新生骨形成軸の細心の調査を可能にすることです。血管新生は、全体の頭蓋欠損を供給する血管樹の正確な高解像度の3Dデモを許可μCTプロトコルを用いて画像化しました。 μCTデータは容易にそのようなIPLソフトウェアなどの高度なツールを用いて分析することができます。例えば、 ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors acknowledge funding from the NIDCR (Grant No. DE019902) and from the Israeli Science Foundation (Grant No. 382/13).
Materials
| C57BL/C Mice | Harlan laboratories | 57 | |
| FVB/n Mice | Harlan laboratories | 862 | |
| Phenobarbital | West waro | NDC 0641-0477-25 | |
| Rodent hair clipper | Wahl animal | 8786-451A | |
| Scalpel 11 | Miltex | 27111504 | |
| Dental micro motor | marathon III | ||
| 5mm trephine | Fine Science tools | 18004-50 | |
| Hair removing cream | Veet | ||
| KetaVed (Ketamine) | Vedco | NDC 50989-996-06 | |
| Domitor | Zoetis | NADA 141-267 | |
| carprofen | Norbrook | 02000/4229 | |
| Eye ointment | Puralube | NDC 17033-211-38 | |
| Operating binocular | Kent scientific | KSCXTS-1121 | |
| Fine scissors | Fine Science tools | 14060-11 | |
| Curve tweezers | Fine Science tools | 11274-20 | |
| Spoon shaped spatula | Fine Science tools | 10090-13 | |
| Tisseel Fibin gel kit | Baxter | 718971 | |
| needle holder | Fine Science tools | 12060-01 | |
| vicryl suture 4-0 | Ethicon | J392H | |
| Antisedan | Zoetis | NADA#141033 | |
| Heparin | Sigma | H3393 | |
| 20ml luerlock | BD | 302830 | |
| 23G scalp vein set (butterfly needle) | BD | 367342 | |
| Hemostat | Fine Science tools | 13008-12 | |
| Syringe pump | Harvard apparatus | PHD 2000 | |
| 3sec gel glue | Scotch | ||
| rodent dissection board | Leica | 38DI02313 | |
| Microfil MV-122 | flow-tech | MV-122 | |
| uCT40 scanner | Scanco | uCT40 | |
| TCA6% | Sigma | T6399 | |
| Osteosense 680 | PerkinElmar | NEV10020EX | |
| Angiosense750 | PerkinElmar | NEV10011 | |
| Oxigen 100% medical grade | |||
| isoflurane (furane) | Baxter | 1001936040 | |
| IVIS kinetics | Xenogen | ||
| Beetle luciferin | Promega | E160A |
References
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