En Semi-automatiske tilgang til Forberedelse Antibody Cocktails for immunfænotypisk Analyse af Human Perifer Blod
Summary
Whole blood Immunophenotyping is indispensable for monitoring the human immune system. However, the number of reagents required and the instability of specific fluorochromes in premixed cocktails necessitates daily reagent preparation. Here we show that semi-automated preparation of staining antibody cocktail helps establish reliable immunophenotyping by minimizing variability in reagent dispensing.
Abstract
Immunfænotypebestemmelse af perifert blod ved flowcytometri bestemmer ændringer i hyppighed og aktiveringsstatus af perifere leukocytter under sygdom og behandling. Det har potentiale til at forudsige terapeutisk effektivitet og identificere hidtil ukendte terapeutiske mål. Fuldblod farvning udnytter umanipulerede blod, hvilket minimerer artefakter, der kan opstå under forberedelsen. Dog skal fuldblod farvning også ske på frisk opsamlede blod for at sikre integriteten af prøven. Derudover, er det bedst at forberede antistof cocktails på samme dag for at undgå potentiel ustabilitet tandem-farvestoffer og forhindre reagens samspil mellem strålende violette farvestoffer. Derfor fuldblod farvning kræver omhyggelig standardisering til at kontrollere for intra og inter-eksperimentel variation.
Her rapporterer vi indsættelse af et automatiseret væskehåndteringsudstyr udstyret med en todimensional (2D) stregkodelæser i en standard proces til fremstilling Antibody cocktails til flowcytometri. Antistoffer blev overført til 2D stregkodede rør anbragt i et 96-brønds format og deres indhold samlet i en database. Den flydende handleren kunne så finde kilden antistof hætteglas ved at referere antistof navne i databasen. Vores metode slået kedelig koordinering til positionering af kilden antistof-rør. Det gav alsidighed gør det muligt for brugeren at nemt ændre vilkårligt antal detaljer i antistof dispenseringsprocessen såsom specifikt antistof til at bruge, volumen og destination ved at ændre databasen uden omskrive scripting i softwaren metode for hver analyse.
En proof of concept eksperiment opnået enestående inter og intra-assay præcision, demonstreret ved gentagen udarbejdelse af en 11-farve, 17-antistof-flowcytometri assay. Disse metoder steg samlet gennemløb til flowcytometri analyser og lettes daglig forberedelse af de komplekse antistof cocktails kræves til detaljeret phenotypic karakterisering af frisk indsamlet antikoaguleret perifert blod.
Introduction
Immunfænotypebestemmelse af humant perifert blod bestemmer kvantitative og kvalitative ændringer i immuncelleundergrupper 1. Det giver indsigt i virkningsmekanismer og modstand, hjælpemidler opdagelse af prædiktive biomarkører, og fremmer udviklingen af kombinationsmuligheder immunterapier. Derfor validering og standardisering af immunofænotypebestemmelse er et område af stor interesse for akademiske forskere, kliniske laboratorier, og industrier.
Selv immunfænotypebestemmelse af perifert blod ved flowcytometriske fremgangsmåder øjeblikket anvendes til kliniske behandling af hæmatologiske maligniteter 2,3 og human immundefekt virus (HIV) infektion 4,5, pålidelig immunofænotypebestemmelse af perifert blod til immunterapi krav særlige overvejelser ved validering og standardisering, fordi det kræver mere omfattende dækning over immuncelleundergrupper og aktivering / hæmmende receptorer 1,6-8. successful immunofænotypebestemmelse kræver omhyggelig standardisering for at minimere eksperiment-til-eksperiment variation relateret til instrument setup og cellen farvningsprocedure 9,10. Mens standardisering af indstillinger instrument for flowcytometri er veletableret for at løse den tidligere bekymring 9,11,12, er det fortsat uklart, hvordan man minimerer variation relateret til cellefarvning uden at begrænse dækningen af immuncelleundergrupper og deres aktivering status.
Da antallet af antigener, der skal påvises stiger, så også gør muligheden for fejl og variabilitet på grund af suboptimal reagens dispensering og krydskontaminering. Metoder til phenoptypic analyse af antikoaguleret helblod blev etableret i slutningen af 1980 til anvendelse i kliniske laboratorieassays. Disse samme metoder tjene behov forskningslaboratorium for prøveforberedelse. Vigtigt er det, antistoffet cocktails anvendes i det kliniske laboratorium er typisk mindre kompliceret og available præ-titreret og forblandes fra producenten. Kun en enkelt overførsel af den forblandede antistofcocktail er påkrævet. I indstillingen forskning, antistof-cocktails af 10-16 antistoffer er typiske. Hver cocktail skal valideres for stabilitet af laboratoriet eller forberedt frisk før hver analyse. Forberedelse flere antistof cocktails for en prøve kan indebære pipettering af 50-80 individuelle antistoffer, en opgave, der er både kedelig og risiko for fejl.
Automatisering af cocktail forberedelse har flere fordele i forhold manuel cocktail forberedelse såsom færre fejl, øget nøjagtighed pipettering, og måske endda faldet reagens spild. Her rapporterer vi den vellykkede indførelse af et automatiseret væskehåndteringsudstyr udstyret med en todimensional (2D) stregkodelæser i cellen-farvning proces med immunfænotypebestemmelse at minimere variabilitet relateret til prøveforberedelse.
Protocol
Representative Results
Discussion
Immunfænotypebestemmelse perifert blod er kritisk vigtigt for at få indsigt i individuelle reaktioner til immunterapi. Udfordringen ligger i assay standardisering at kontrollere eksperiment-til-eksperiment variabilitet 1,14. Én vigtigste kilde til variabilitet ligger i den menneskelige manipulation af prøverne. Derfor er det tænkeligt, at en delvis eller fuld automatisering af prøve behandling vil lette en dramatisk reduktion i eksperiment-til-eksperiment variabilitet 1,14. I denne protokol, rapporterer vi vores succesfulde indsats for at minimere assay variationen ved at indføre en automatiseret flydende handler udstyret med 2D-stregkodelæser for prøve farvning i fuldblod immunfænotypebestemmelse.
I design, vores metode er alsidig og kan overvåge andre immune delmængder ved at tilføje yderligere "Base Cocktails" til at definere dem. Sådanne undergrupper indbefatter T-hjælperceller, T regulerende celler, B-celler, NK-celler, dendritiske celler og monocytter (manuskript iforberedelse) 18. Vi tilpassede konsortiets anbefalede antistof paneler ved at indføre yderligere en markører. Cellepopulationer blev identificeret ved hjælp af "Base Cocktail" konjugeret til fluorochromer med minimal emission til strålende violette 421 (BV421), phycoerythrin (PE), og allophycocyanin (APC) detektorer, som vi ønskede at reservere disse kanaler til påvisning af inducerbare antigener. Denne funktion sikrer ikke kun den højeste følsomhed til at overvåge aktivering status af immunceller, men også muliggør fleksibel indkvartering af nye aktivering markører som disse tre fluorochromer oftest konjugeret med antistoffer mod inducerbare markører. Derfor er vores fremgangsmåde er ikke kun egnet til cocktail forberedelse til fuldblod immunofænotypebestemmelse men er også anvendelig til farvning andre prøver, herunder perifere mononukleære blodceller og celler udvundet fra disaggregerede væv (fx tumor).
vellykket introduktion af vores metode kræver særlig opmærksomhed på trin i laboratorieudstyr forberedelse, og programmering og udførelse af metoden. Fremstilling af 2D stregkode rør omfatter mærkning med menneskeligt læsbare etiketter og overføring af antistofferne til de udpegede rør. For at forhindre indførsel af fejl, anbefaler vi at gøre dette med to personer. Når skiftende regneark, skal efterforskerne kontrollere, om metoden virker ordentligt. Vælge passende pipettering metoder under programmering sikrer succesfuld flydende overførsel. LLS muliggør pipettering uden at få udfældet vragrester fra bunden af antistof rør, som vi bruger enten P50 eller P200 ledende tip. LLS kan ikke være en god mulighed for P1000 tips LLS er mere følsom med P1000 tips og nogle gange fejlagtigt udløst af tilstedeværelsen af bobler. Heights i labware definition bør justeres for hvert instrument som suboptimal flydende overførsel kunne ske, for eksempel, hvis der ikke er tilstrækkelig plads mellem kanten af tipsog bunden af rørene. Som vist i figur 12, hvis "Base Cocktail" og / eller "Activation Cocktail" ikke hvirvles godt, kan det resultere i suboptimal farvning.
Vi tænkte at bruge frysetørrede reagenser til cellefarvning som en alternativ tilgang til at nedbringe variation relateret til reagens dispensering 19. Imidlertid er polymerkonjugater af strålende violet farvestoffer kendt for at interagere med hinanden forårsager ikke-specifikke signaler. Som sådan, tilføjer mere end to polymerkonjugater (f.eks BV421 og BV650 etc.) i lyofiliseret reagenser kan forårsage ikke-specifik signalering (f.eks forøgelse af BV650 baggrundssignal i BV421 + population) 20. Desuden frysetørrede reagenser mangler fleksibilitet for herunder ny farvning. De er som regel dyrere og kræver en bulk orden. Af disse grunde har vi valgt at bruge automatiserede flydende handleren udstyret med 2D stregkode rør. Selvom det takes tid til at etablere og indebærer en upfront investering at købe instrumentet, i det lange løb sådanne faktorer vil blive opvejet af den øgede produktivitet og reproducerbarhed af analyser. Faktisk nogle få grupper tidligere rapporteret en vellykket integration af den automatiserede væske handleren i deres arbejdsgang af immunofænotypebestemmelse eller lignende applikationer 21,22. Automatiserede løsninger til flowcytometri analyse er også tilgængelige fra kommercielle kilder (FACS SPA III, Automated Cocktail Forberedelse Workstation, og FlowStainer). Dette indikerer yderligere er der et stort behov for automatiseret cocktail forberedelse til immunfænotypebestemmelse.
Efter mastering denne teknik, forestiller vi, at udviklingen af fuldt automatiseret fuldblod immunofænotypebestemmelse yderligere vil reducere eksperiment-til-eksperiment variabilitet og kan gøre fuldblod immunofænotypebestemmelse muligt selv i et multicenter klinisk forsøg indstilling 23. Vi er allerede begyndt at bruge en lyse varh assistent at automatisere lysis og vasketrin. Vi forestiller os også, at automatiseret bestemmelse af mængden af antistof i 2D stregkode rør og sporing af reagens dispensering i høj grad vil forbedre opgørelse af antistoffer og kvaliteten kontrol over vores metode, hhv.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Hannah Puzas for assistance with system design and configuration, and Kevin Khovananth for technical advice. Funding for this work was provided by The Hearst Foundations and the Providence Portland Medical Foundation.
Materials
| BD LSRFortessa | BD Biosciences | Flow cytometer | |
| NXp Span-8 Laboratory Automation Workstation | Beckman Coulter | A31839 | Laboratory Automation Workstation |
| Insert, Tube, 11 mm, White, for 1.5 mL Microfuge Tubes (case of 25) | Beckman Coulter | 373696 | Accessary for 24-Position Tube Rack to accommodate microfuge tubes. |
| LLS kit | Beckman Coulter | 719262 | Attach bottom of the deck in Laboratory Automation Workstation to enable liquid level sensing |
| 24-Position Tube Rack | Beckman Coulter | 373661 | Tube rack to hold microfuge tubes for antibody cocktails or blood |
| BIOHAZARD AUTOCLAVE BAGS 12×24 IN. RED | LabMart | M111416 | Disposable autoclave bags for the Laboratory Automation Workstation |
| VisionMate High Speed 2D Barcode Reader | Thermo Scientific | AB-1850 | 2D barcode reader |
| 8-Channel Handheld Screw Cap Capper/Decapper | Thermo Scientific | 4105MAT | For de-capping and capping 2D barcode tubes |
| Microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | 02-681-335 | For making cocktail in or supplying blood speciment to the Laboratory Automation Workstation |
| CoolRack XT CFT24 | biocision | BCS-534 | To hold sample tubes. |
| 1.0 mL Matrix ScrewTop Amber Tubes in Latch Racks | Thermo Scientific | 3741AMB | 2D barcode tubes to store fluorescent dye-cojugated antibodies |
| Biomek Span-8 P1000 Tips, Conductive, Pre-sterile with Barrier, 1025 µL | Beckman Coulter | 987925 | Tips for Laboratory Automation Workstation |
| Biomek Span-8 P50 Tips, Conductive, Pre-sterile with Barrier, 50 µL (Case of 10 racks) | Beckman Coulter | B01091 | Tips for Laboratory Automation Workstation |
| Biomek Span-8 P250 Tips, Conductive, Pre-sterile with Barrier (Case of 10 racks) | Beckman Coulter | 394627 | Tips for Laboratory Automation Workstation |
| BD FACS Lysing Solution 10X Concentrate | BD Biosciences | 349202 | RBC lysis |
| Falcon Round-Bottom Polystyrene Tubes | Fisher Scientific | 14-959-5 | Sample tubes |
| Anti-CD45 FITC | BD Biosciences | 347463 | Effector T cell panel (base) |
| Anti-CD3 Alexa Fluor 700 | eBioscience | 56-0038-42 | Effector T cell panel (base) |
| Anti-CD4 PerCPCy5.5 | BD Biosciences | 341654 | Effector T cell panel (base) |
| Anti-TCRgd BV650 | BD Biosciences | 564156 | Effector T cell panel (base) |
| Anti-TCRab BV786 | BD Biosciences | 563825 | Effector T cell panel (base) |
| Anti-CD8 APC-H7 | BD Biosciences | 560179 | Effector T cell panel (base) |
| Anti-CCR7 PE-CF594 | BD Biosciences | 562381 | Effector T cell panel (base) |
| Anti-CD45RA PE-Cy7 | BD Biosciences | 337167 | Effector T cell panel (base) |
| Anti-HLA-DR BV421 | BD Biosciences | 562804 | Effector T cell panel (activation) |
| Anti-CD278(ICOS) PE | BD Biosciences | 557802 | Effector T cell panel (activation) |
| Anti-CD38 APC | BD Biosciences | 340439 | Effector T cell panel (activation) |
| Anti-CD279(PD1) BV421 | BD Biosciences | 562516 | Effector T cell panel (activation) |
| Anti-CD357(GITR) PE | eBioscience | 12-5875-42 | Effector T cell panel (activation) |
| Anti-CD137(41BB) APC | BD Biosciences | 550890 | Effector T cell panel (activation) |
| Anti-CD69 BV421 | BD Biosciences | 562884 | Effector T cell panel (activation) |
| Anti-CD314(NKG2D) PE | BD Biosciences | 557940 | Effector T cell panel (activation) |
| Anti-CD134(OX40) APC | BioLegend | 350008 | Effector T cell panel (activation) |
| BD Vacutainer Plastic Blood Collection Tubes with Sodium Heparin: Conventional Stopper | Fisher Scientific | 02-689-6 | For collecting blood |
| Albumin, Bovine Serum, Fraction V, RIA and ELISA Grade | EMD Millipore | 126593 | For flow wash buffer |
| Sodium Azide | Sigma-Aldrich | S8032 | For flow wash buffer |
| Heparin, sodium salt | Affimetrix | 16920 | For flow wash buffer |
| Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS), 1X, with Calcium, Magnesium, without Phenol Red | GE Healthcare Life Sciences | SH30588.02 | For flow wash buffer |
References
- Maecker, H. T., McCoy, J. P., Nussenblatt, R. Standardizing immunophenotyping for the Human Immunology Project. Nat. Rev. Immunol. 12 (3), 191-200 (2012).
- Craig, F. E., Foon, K. A. Flow cytometric immunophenotyping for hematologic neoplasms. Blood. 111 (8), 3941-3967 (2008).
- Johansson, U., Bloxham, D., et al. Guidelines on the use of multicolour flow cytometry in the diagnosis of haematological neoplasms. Br. J. Haematol. 165 (4), 455-488 (2014).
- Schnizlein-Bick, C. T., Spritzler, J., et al. Evaluation of TruCount Absolute-Count Tubes for Determining CD4 and CD8 Cell Numbers in Human Immunodeficiency Virus-Positive Adults. Clin. Vaccine Immunol. 7 (3), 336-343 (2000).
- Cossarizza, A., De Biasi, S., et al. Cytometry, immunology, and HIV infection: Three decades of strong interactions. Cytometry A. 83 (8), 680-691 (2013).
- Hensley, T. R., Easter, A. B., et al. Enumeration of Major Peripheral Blood Leukocyte Populations for Multicenter Clinical Trials Using a Whole Blood Phenotyping Assay. J. Vis. Exp. (67), e4302 (2012).
- Streitz, M., Miloud, T., et al. Standardization of whole blood immune phenotype monitoring for clinical trials: panels and methods from the ONE study. Transplant. Res. 2 (1), 17 (2013).
- Hensley-McBain, T., Heit, A., De Rosa, S. C., McElrath, M. J., Andersen-Nissen, E. Optimization of a whole blood phenotyping assay for enumeration of peripheral blood leukocyte populations in multicenter clinical trials. J. Immunol. Methods. 411, 23-36 (2014).
- Green, C. L., Brown, L., Stewart, J. J., Xu, Y., Litwin, V., Closkey, T. W. M. Recommendations for the validation of flow cytometric testing during drug development: I instrumentation. J. Immunol. Methods. 363 (2), 104-119 (2011).
- O’Hara, D. M., Xu, Y., Liang, Z., Reddy, M. P., Wu, D. Y., Litwin, V. Recommendations for the validation of flow cytometric testing during drug development: II assays. J. Immunol. Methods. 363 (2), 120-134 (2011).
- Owens, M. A., Vall, H. G., Hurley, A. A., Wormsley, S. B. Validation and quality control of immunophenotyping in clinical flow cytometry. J. Immunol. Methods. 243 (1-2), 33-50 (2000).
- Kalina, T., Flores-Montero, J., et al. EuroFlow standardization of flow cytometer instrument settings and immunophenotyping protocols. Leukemia. 26 (9), 1986-2010 (2012).
- Calvelli, T., Denny, T. N., Paxton, H., Gelman, R., Kagan, J. Guideline for flow cytometric immunophenotyping: a report from the National Institute of Allergy and Infectious Diseases, Division of AIDS. Cytometry A. 14 (7), 702-715 (1993).
- Biancotto, A., McCoy, J. P. Studying the human immunome: the complexity of comprehensive leukocyte immunophenotyping. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 377, 23-60 (2014).
- Perfetto, S. P., Ambrozak, D., Nguyen, R., Chattopadhyay, P., Roederer, M. Quality assurance for polychromatic flow cytometry. Nat. Protoc. 1 (3), 1522-1530 (2006).
- Yong, P. F. K., Salzer, U., Grimbacher, B. The role of costimulation in antibody deficiencies: ICOS and common variable immunodeficiency. Immunol. Rev. 229 (1), 101-113 (2009).
- Donnenberg, A. D., Donnenberg, V. S. Rare-Event Analysis in Flow Cytometry. Clin. Lab. Med. 27 (3), 627-652 (2007).
- Biancotto, A., Fuchs, J. C., Williams, A., Dagur, P. K., McCoy, J. P. High dimensional flow cytometry for comprehensive leukocyte immunophenotyping (CLIP) in translational research. J. Immunol. Methods. 363 (2), 245-261 (2011).
- Villanova, F., Di Meglio, P., et al. Integration of Lyoplate Based Flow Cytometry and Computational Analysis for Standardized Immunological Biomarker Discovery. PloS One. 8 (7), e65485 (2013).
- BD biosciences. . Optimizing Experiments Using BD Horizon Brilliant Polymer Conjugates. , (2014).
- Malergue, F., van Agthoven, A., Scifo, C., Egan, D., Strous, G. J. Automation of a Phospho-STAT5 Staining Procedure for Flow Cytometry for Application in Drug Discovery. J. Biomol. Screen. 20 (3), 416-421 (2015).
- Hasan, M., Beitz, B., et al. Semi-automated and standardized cytometric procedures for multi-panel and multi-parametric wholeblood immunophenotyping. Clin. Immunol. 157 (2), 261-276 (2015).
- Maecker, H. T., McCoy, J. P., et al. A model for harmonizing flow cytometry in clinical trials. Nat. immunol. 11 (11), 975-978 (2010).
