Abstract
Imunofenotipagem do sangue periférico por fluxo determina citometria de mudanças no status de leucócitos periféricos frequência e activação durante a doença e tratamento. Tem o potencial para prever a eficácia terapêutica e identificar novos alvos terapêuticos. coloração de sangue total utiliza sangue não manipulada, o que minimiza artefactos que podem ocorrer durante a preparação da amostra. No entanto, a coloração sangue total deve também ser feito sobre o sangue colhido de fresco para garantir a integridade da amostra. Além disso, é melhor se preparar cocktails de anticorpos no mesmo dia, para evitar potenciais instabilidade do tandem, corantes e evitar a interação reagente entre corantes violeta brilhante. Portanto, a coloração de sangue total requer cuidadosa padronização para controlar a variabilidade intra e inter-experimental.
Aqui, nós relatamos a implantação de um manipulador de líquidos automatizado equipado com um bidimensional (2D) leitor de código de barras em um processo padrão de fazer Antibodcocktails y para citometria de fluxo. Os anticorpos foram transferidos para tubos de código de barras 2D arranjados num formato de 96 poços e os seus conteúdos compilados numa base de dados. O manipulador de líquido pode então localizar os frascos de anticorpos fonte referenciando nomes de anticorpos dentro do banco de dados. O nosso método eliminado coordenação entediante para o posicionamento dos tubos de anticorpos de origem. Forneceu versatilidade permitindo que o usuário altere facilmente qualquer número de detalhes no processo de distribuição de anticorpo, tal como um anticorpo específico para usar, volume e destino, modificando o banco de dados sem reescrever o script no método de software para cada ensaio.
A prova de conceito experimento alcançado notável precisão do ensaio inter e intra, demonstrado pela preparação réplica de um 11-cor, fluxo de 17 anticorpo citometria de ensaio. Estas metodologias maior rendimento global de citometria de fluxo ensaios e facilitou a preparação diária dos cocktails de anticorpos complexos necessários para a pheno detalhadacaracterização typic de sangue periférico anticoagulado de colheita recente.
Introduction
Imunofenotipagem do sangue periférico humano determina alterações quantitativas e qualitativas em subconjuntos de células imunitárias 1. Ele fornece insights sobre os mecanismos de ação e resistência, descoberta ajudas de biomarcadores preditivos, e facilita o desenvolvimento de imunoterapias combinação. Portanto, a validação e padronização de imunofenotipagem é uma área de grande interesse para pesquisadores acadêmicos, laboratórios clínicos, e indústrias.
Embora imunofenotipagem do sangue periférico por métodos de citometria de fluxo é usado atualmente para o manejo clínico de doenças malignas hematológicas 2,3 e vírus da imunodeficiência humana (VIH) 4,5, imunofenotipagem confiável de sangue periférico para as demandas de imunoterapia considerações específicas na validação e padronização porque requer mais extensa cobertura sobre subconjuntos de células imunes e ativação de receptores inibitórios / 1,6-8. succeimunofenotipagem ssful exige padronização cuidadosa para minimizar a variabilidade experimento-a-experimento relacionado à configuração do instrumento e do processo de coloração de células 9,10. Enquanto padronização das definições do aparelho para citometria de fluxo está bem estabelecido para resolver o ex preocupação 9,11,12, não se sabe como para minimizar a variabilidade relacionada com coloração celular sem restringir a cobertura de subconjuntos de células imunes e seu estado de ativação.
À medida que o número de antigénios a serem detectados aumenta, o mesmo acontece com a oportunidade de erro e a variabilidade devido à distribuição do reagente sub-óptima e a contaminação cruzada. Métodos de análise phenoptypic de sangue total anticoagulado foram estabelecidas na década de 1980 atrasado para utilização em ensaios de laboratório clínico. Estes mesmos métodos servir as necessidades do laboratório de pesquisa para preparação de amostras. Importante, as misturas de anticorpos utilizados nos laboratórios clínicos são tipicamente menos complexo e Available pré-titulado e pré-misturado a partir do fabricante. Apenas uma única transferência do cocktail de anticorpos pré-misturado é necessária. No contexto de investigação, misturas de anticorpos de anticorpos 10-16 são típicos. Cada cocktail deve ser validado para a estabilidade pelo laboratório ou preparada antes de cada ensaio. Preparando vários cocktails de anticorpos para uma amostra possam implicar a pipetagem de 50-80 anticorpos individuais, uma tarefa que é tediosa e propensa a erros.
Automatização de preparação de cocktail tem várias vantagens sobre a preparação cocktail manual de como menos erros, maior precisão de pipetagem, e possivelmente até mesmo diminuiu o desperdício de reagente. Aqui, nós relatamos a introdução bem sucedida de um manipulador de líquidos automatizado equipado com um bidimensional (2D) leitor de código de barras para o processo de coloração de células da imunofenotipagem para minimizar a variabilidade relacionada com a preparação da amostra.
Protocol
Obtenção e utilização de sangue periférico neste protocolo foi aprovado pelo Providence Health & Serviços Institutional Review Board. Todos os seres humanos desde que o seu consentimento informado por escrito.
Nota: Siga as precauções universais. Todo o sangue humano deve ser tratado como se infecciosas e tratadas em conformidade com Nível de Biossegurança 2 práticas.
Nota: imunofenotipagem com sangue total periférico é realizada incubando sangue total anticoagulado com anticorpos monoclonais fluorescentes marcadas para detectar antigenes da superfície celular, seguidas de lise hipotónico para remover os glóbulos vermelhos. As células são lavadas e a amostra é analisada por um citómetro de fluxo. O método aqui descrito centra-se na preparação das misturas de anticorpos, usando o manipulador de líquidos automatizado equipado com um leitor de código de barras 2D. Primeiro, o "Cocktail Base" que identifica subpopulações de células imunes e "Cocktail Activation" que monitora inducible antigénios são preparados separadamente (Tabela 1). Em seguida, ambos os cocktails são misturados para criar um "Master Antibody Cocktail". Veja a Figura 1 para o fluxo de trabalho.
1. Specimen
- Recolha de sangue periférico por meio de punção venosa em um tubo de coleta de sangue anticoagulado heparina sódica, inverter suavemente várias vezes para assegurar a mistura adequada, e em seguida, mantenha à temperatura ambiente. Rejeitar espécime se coagulado ou hemólise 13.
2. Os instrumentos de laboratório Preparação
- Etiqueta 2D tubos de código de barras com etiquetas legíveis (nome anticorpo, vender, número de catálogo e número de lote).
- Transferir todo o conteúdo de frascos de anticorpo a partir do vendedor (listados na Tabela 1) a tubos correspondente código de barras 2D.
Nota: Tome muito cuidado para não introduzir bolhas como bolhas falsamente acionar detecção de nível de líquido (LLS) que resulta na transferência de sub-óptima de reagente.
Nota: Certifique-se de que cada vi anticorpoal possui anticorpos suficientes para a execução. - Leia o código de barras 2D para cada tubo pelo leitor de código de barras 2D.
- Faça uma planilha que contém os nomes de anticorpo (AB) e código de barras lê (BC), utilizando um software de planilha e salvá-lo em uma vírgula arquivo valores separados (CSV) como "AB_BC.csv" (Tabela 2).
Nota: Certifique-se de formatar células como "Texto" não "Número", a fim de manter o primeiro "0" para os números de código de barras se houver (por exemplo, 0163562544). Adicionar "X, 0000000000" no final para especificar final dos dados. - Screw LLS placas de metal à estrutura do convés no hander líquido automatizado para permitir LLS.
3. Programação para o líquido Handler Automated
Nota: Dois métodos serão programados no software para o manipulador de líquidos automatizado: a) um método para fazer "cocktail base" e "cocktail Activação" em 3.1), e b) um método para fazer "mestre AntiboCocktail dy "combinando o" cocktail base "e" cocktail Activação "em 3,2) (Figura 1).
- Criar um método para fazer o "cocktail base" e "cocktail Activação" (Figura 2).
- Usando o software de planilhas, fazer uma planilha que tem informações para nomes de anticorpos (AB_NAME), localização tubo de destino (BEM-BASE ou BEM-ACT), e volume (VOL) em ul para "Cocktail Base" com dicas P50 (BASE_CT_P50: Table 3) ou dicas P200 (BASE_CT_P200: Tabela 4) e "Cocktail Activation" com dicas P50 (ACT_CT_P50: Tabela 5) ou dicas P200 (ACT_CT_P200: Tabela 6). Salvá-los como arquivos CSV. Para "Bem-BASE" e "bem-ACT" localização, referem-se aos números na Figura 3.
Nota: vol = titulo x (# de coloração + 2) ul. Os títulos da Tabela 1 são específicos do lote. Operador deve determinar uma tetaer para cada anticorpo como descrito por outros 14. - Clique em um ícone para abrir o software para o manipulador de líquidos automatizado no computador para criar um método para fazer "Cocktail Base" e "Cocktail Activation".
Nota: Os seguintes passos 3.1.3-3.1.7 definirão o material de laboratório: o suporte de tubos com tubos de código de barras 2D (Figura 4). As medições são fornecidos como uma referência. Os investigadores devem determinar e ajustar para cada instrumento. - Na barra de ferramentas sob o título "Projeto", selecione "médico laboratorial Tipo Editor". Clique com o botão direito do mouse sobre um objeto para uma placa bem plana 96, selecione "Copiar" e digite "Matrix_OneML_TubeRack" em uma janela pop-up.
- Dê um duplo clique no objeto "Matrix_OneML_TubeRack" para abrir a caixa de diálogo. Realce "Informações básicas", definido 12.775 cm (X) e 8.546 cm (Y) para "Span" e 4.625 cm para "Altura". (Figura 4A).
- Em seguida, destaque "movemInformações ent ". Definir Gripper deslocamento 0 (X), 0 (Y) e 0,3 (Z), Gripper Squeeze -0.1cm, Gripper Unsqueeze 2,6 cm, limite de velocidade de 75%, e, em seguida, marque a opção" Use o sensor de pinça "(Figura 4B).
- Então, destaque "Well_1". Definido da seguinte forma: "Bem Offset"; 1,5 cm (X) e 1,13 cm (Y), "Bem Contagem"; 12 (X) e 8 (Y), "Bem Espaçamento"; 0,9 (X) e 0,9 (Y), "Máximo volume"; 1.500 l, Format "; regular," Colum 2 Offset "; 0, e" Volume Default "; 0 (Figura 4C).
- Finalmente, pressione o "Editar ..." botão à direita de "Configuração do Bem" (Figura 4C). Em uma janela pop-up, definido da seguinte forma: "Shape"; Rodada ", superior Radius"; 0,37 cm, "Lower Radius"; 0,37 cm, e "Altura"; 3,9 cm. Verifique "Seção de fundo" e definir "Shape"; Cone, "Raio"; 0,37 cm, e "Altura"; 0,4 cm (Figura 4D).
Nota: Os passos seguintes 3.1.8-3.1.11 irá definir o material de laboratório: o suporte de tubos com tubos de microcentrífuga. As medições são fornecidos como uma referência. Os investigadores devem determinar e ajustar para cada instrumento. - Na barra de ferramentas sob o título "Projeto", selecione "médico laboratorial Tipo Editor". Clique com o botão direito do mouse sobre um objeto para um rack de 24 posições, selecione "SmallTuberack_microfugetubes" "Copiar" e tipo.
- Dê um duplo clique no objeto "SmallTuberack_microfugetubes" para abrir a caixa de diálogo. Realce "Informações básicas", defina 12,75 cm (X) e 8,5 cm (Y) para "Span" e 3,95 cm para "Altura".
- Em seguida, destacar "Well_1". Definido da seguinte forma: "Bem Offset"; 1.621 cm (X) e 1.181 cm (Y), "Bem Contagem"; 6 (X) e 4 (Y), "Bem Espaçamento"; 1,9 (X) e 1,9 (Y), "Máximo volume"; 1.000 l, Format "; regular," Colum 2 Offset "; 0, e" Volume Default "; 0.
- Finalmente, pressioneum "Editar ..." botão à direita de "Configuração do Bem". Em uma janela pop-up, definido da seguinte forma: "Shape"; Rodada ", superior Radius"; 0.3345 cm, "Lower Radius"; 0,274 cm, e "Altura"; 3.6728 cm. Verifique "Seção de fundo" e definir "Shape"; Hemisfério, e "Raio"; 0.1575 cm.
Nota: Os passos seguintes 3.1.12-3.1.35 irá explicar como programar o "Novo Método" para fazer a "Cocktail Base" e "Cocktail Activation" (Figura 2). - Clique no ícone "Novo Método" e aberto.
- Arraste um "se" ícone entre um e ícone "Iniciar" em "Concluir" no novo método (Figura 2). Clique e realce o "se" ícone. Digite o seguinte para o Estado:. CreateObject ( "World.EngineObject") simulando
Nota: Isso impedirá que o software de executar a verificação de erros e permitir que esse método funcione. Sem este passo, o Software irá alertar informação em falta para conjunto de dados como código de barras lê só estão disponíveis após a etapa de "VisionMate: Lê códigos de barras" descrito no 3.1.20). Uma vez que este passo desactiva a etapa de verificação no software, o operador deve confirmar que não há o suficiente dicas e reagente na plataforma para executar este método. - Insira um ícone "Configuração do Instrumento" entre o "Então" ícone e o primeiro ícone "End" no âmbito do "SE" ícone (Figura 2).
Nota: Para todas as etapas a seguir, arraste ícones entre o ícone "Else" e o segundo ícone "End" sob o ícone "IF", para que passos são encapsuladas no "Else". - Arraste o ícone "Configuração do Instrumento" abaixo do ícone "Else" no método (Figura 2).
- Clique no ícone "Configuração do Instrumento" no método para abrir a janela. Configurar Labwares por ícones para P50 LLS filtrados dicas arrastando, dicas P200 LLS filtrados, P1000 dicas, "Matrix_OneML_TubeRack", dois "SmallTuberack_microfugetubes", e reservatório para localização deck correspondente da lista de ícones.
- Abra a caixa de diálogo para o "Matrix_OneML_TubeRack" e nome como "AB_BOX". Abra a caixa de diálogo para os "SmallTuberack_microfugetubes" e nomear um como "BASE_CT" para Cocktails Base e o outro como "ACT_CT" para Cocktails activação (Figura 5).
- Arrastar um ícone de "transferência" para o método (Figura 2) para adicionar um passo para a transferência de tampão a partir do reservatório para dentro de tubos de microcentrífuga para "cocktail base" e "cocktail Activação". volume de transferência = 25 ul x (número de coloração +2) para "Cocktail Base" e = 25 ul x (número de coloração +2) para "Cocktail de ativação".
- Adicionar etapas para mover o "Matrix_OneML_TubeRack" para o leitor de código de barras 2D. Arraste um ícone "VisionMate Move" com o método (Fifigura 2) e especificar o movimento a partir da posição plataforma inicial para a posição do leitor de código de barras no convés.
- Arrastar um "VisionMate: Lê códigos de barras" ícone para o método (Figura 2). Abra a caixa de diálogo, e escolha "VisionMate" como o dispositivo e nomear o conjunto de dados como "BC_Read".
- Arraste um "Pause User" (Figura 2), selecione "Pause todo o sistema e exibir esta mensagem" e escreva um comentário no campo para lembrar os usuários de confirmar que todos os códigos de barras são lidos antes de prosseguir para a próxima etapa.
Nota: Os passos seguintes 3.1.22-3.1.26 irá ligar entre locais bem e nomes de anticorpos, por meio de informações de código de barras. Isto irá permitir que o manipulador de líquidos automatizado para encontrar um local de o anticorpo particular com base no nome de anticorpo "AB". - Arrastar um ícone de "Relatórios Passo" para o método (Figura 2).
- Faça um arquivo de texto usando um editor de texto e salvá-locomo "BC_Readout" na pasta de documentos no computador.
- Abra a caixa de diálogo para "Relatórios Step", escolha "Arquivo de texto" para o Report Style, e selecione o arquivo "BC_Readout" através de navegação.
Nota: O arquivo "BC_Readout" resultante conterá informações para todos os Labwares no convés, exceto dicas conforme configurado no 3.1.16, incluindo informações para código de barras lê para os tubos de código de barras 2D e localização dos poços no "Matrix_OneML_TubeRack". - Adicionar um "Criar conjunto de dados" passo para vincular código de barras e informações bem. Arraste o ícone "Criar conjunto de dados" para o método (Figura 2), clique nele para abrir a caixa de diálogo, selecione "Ler de um arquivo" e selecione "AB_BC.csv" (Tabela 2 criado em 2.4), marque "por vírgulas delimitado "e" O arquivo tem uma linha de cabeçalho ".
Nota: Na janela de visualização do arquivo, nomes de anticorpo (AB) e código de barras lê (BC) deve ser visto. - Nos scaixa de diálogo ame para "Criar conjunto de dados" em 3.1.25, selecione "VM1" para a localização material de laboratório e "0" para profundidade da pilha, selecione "Combine o ID Amostra", e use o campo "BC" para coincidir com o Data Defina "BC_Read". Selecione "AB" e "BC" para "conjuntos de dados a Criado" (Figura 6).
- Arraste um ícone "VisionMate Move" com o método (Figura 2) e especificar o movimento da posição do leitor de código de barras "VM1" de volta à posição inicial convés no convés.
Nota: Os passos seguintes 3.1.28-3.1.33 definirá etapa de transferência para "Cocktail Base". - Arraste um ícone "Lista de trabalho" (Figura 2) e navegue para selecionar o arquivo de lista de trabalho "Base_CT_P50" (Tabela 3), criado em 3.1.1. Marque a opção "toda laço lista de trabalho".
- Arraste o ícone "Transfer" diretamente abaixo do ícone "Lista de trabalho" (Figura 2). </ Li>
- Clique no ícone "Transfer" para abrir o campo de especificação. Escolha apenas uma das sondas, P50 LLS dicas filtrados, selecione "descarregá-los" quando a transferência é feita, e verificar "Alterar dicas entre as transferências". Adicionar fonte, clicando em "Clique aqui para adicionar uma fonte", selecione "Matrix_OneML_TubeRack" como um material de laboratório, e selecione o local no convés pelo nome "AB_BOX".
- No campo especificação para "Transfer", "Zoom in" no diagrama de 96 poços clicando com o botão direito e escolha "AB" imediatamente após "Use conjunto de dados" e selecione onde os seus valores "são iguais" e "= AB_NAME" . Select técnica de transferência de escolha.
Nota: O uso de LLS é altamente recomendado para evitar detritos precipitou perto inferior. - No campo especificação para "Transfer", escolha o destino, clicando em "Clique aqui para adicionar um destino", clique direito para fazer zoom e selecione "SmallTuberack_microfugetubes "como um material de laboratório, o volume como" = VOL ", e localização na plataforma por nome" BASE_CT ". Após o zoom para fora, botão direito do mouse novamente, verifique" especificar a seleção como texto ", e verificar" Especificar as metas com a expressão a seguir: "e digite" = WELL_BASE "como uma variável para uma posição de plataforma de destino.
- Repita 3.1.29-3.1.32 semelhante para "Cocktail Base" com dicas P200, selecionando o arquivo CSV "Base_CT_P200" (Tabela 4), em seguida, escolher P200 LLS dicas, bem como técnica de pipeta apropriada filtrados para P200 LLS dicas filtradas.
Nota: Os passos seguintes 3.1.34 e 3.1.35 definirá etapa de transferência para "Cocktail de ativação". - Repita 3.1.29-3.1.32 semelhante para "Cocktail Activation" com dicas P50, selecionando o arquivo CSV "ACT_CT_P50" (Tabela 5) e escolhendo "ACT_CT" como um destino. clique com o botão direito do destino e verificar "especificar a seleção como texto";. Marque a opção "Especificar os alvos com a expressão a seguir:" e digite "= WELL_ACT" como uma variável para uma posição de destino.
- Repita 3.1.34 semelhante para "Cocktail Activation" com dicas P200, selecionando o arquivo CSV "ACT_CT_P200" (Tabela 6) e dicas P200 LLS filtrados.
Nota: O método para fazer "Cocktail Base" e "Cocktail Activation" pode ser fechada depois de salvar.
- Usando o software de planilhas, fazer uma planilha que tem informações para nomes de anticorpos (AB_NAME), localização tubo de destino (BEM-BASE ou BEM-ACT), e volume (VOL) em ul para "Cocktail Base" com dicas P50 (BASE_CT_P50: Table 3) ou dicas P200 (BASE_CT_P200: Tabela 4) e "Cocktail Activation" com dicas P50 (ACT_CT_P50: Tabela 5) ou dicas P200 (ACT_CT_P200: Tabela 6). Salvá-los como arquivos CSV. Para "Bem-BASE" e "bem-ACT" localização, referem-se aos números na Figura 3.
- Criar um novo método para fazer "Mestre Antibody Cocktail", combinando "Cocktail Base" e "Cocktail ativação" em 5 ml tubos de poliestireno de fundo redondo (Figura 7).
Nota: Os seguintes passos 3.2.1-3.2.6 irá definir o material de laboratório: o suporte de tubos com 5 ml tubos de poliestireno de fundo redondo. Os números são fornecidos para referência. Os investigadores devem determinar e ajustar para o instrumento.- Na barra de ferramentas sob o título "Projeto", selecione "médico laboratorial Tipo Editor". Direito do click em um objeto para o rack de 24 posições, selecione "Copiar" e digite "BiocisionCoolRack_XT" em uma janela pop-up.
- Dê um duplo clique no objeto "BiocisionCoolRack_XT" para abrir a caixa de diálogo.
- Realce "Informações básicas", defina 12,78 cm (X) e 8,57 cm (Y) para "Span" e 7,93 cm para "Altura".
- Realce "Well_1". Definido da seguinte forma: "Bem Offset"; 1,55 cm (X) e 1,33 cm (Y), "Bem Contagem"; 6 (X) e 4 (Y), "Bem Espaçamento"; 1,95 (X) 1,97 e (Y), "Máximo volume"; 2.000 l, Format "; regular," Colum 2 Offset "; 0, e" Volume Default "; 0.
- Abrir "Configuração Bem" para editar. Definido da seguinte forma: "Shape"; Rodada ", superior Radius"; 0.5375 cm, "Lower Radius"; 0,48 cm, e "Altura"; 7.07 cm. Verifique "Seção de fundo" e definir "Shape"; Hemisfério, e "Raio"; 0,45 cm.
Nota: Os passos seguintes3.2.6-3.2.7 definirá passos de transferência e de ser utilizado no passo 3.2.14. - Criar um arquivo CSV "AB_MACT" (Tabela 7) para fazer cocktail de anticorpos com os seguintes cabeçalhos: a) "SRC_BASE"; um nome de material de laboratório para "Cocktail Base", b) "WELL_BASE"; bem localidades do material de laboratório para "Cocktail Base", c) "VOL_BASE"; volume de transferência para "Cocktail Base" em l, d) "SRC_ACT"; um nome de material de laboratório para "Cocktail de ativação", e) "WELL_ACT"; bem localidades do material de laboratório para "Cocktail de ativação", f) "VOL_ACT"; volume de transferência para "Cocktail de ativação" em l, g) "DEST_MACT"; informações sobre a posição da plataforma para "Mestre Antibody Cocktail", e h) "WELL_MACT"; bem posicionar informações no suporte de tubos para "Mestre Antibody Cocktail".
- Preencha as informações em cabeçalhos criados em 3.2.6) (Tabela 7) da seguinte forma: a) usar "BASE_CT"sob SRC_BASE, b) informação lista bem localização para "WELL_BASE" como mostrado na Figura 3A, c) lista de volume total de anticorpos (25 ul de tampão + soma de todos os títulos de anticorpos de base para a coloração única) em "VOL_BASE", d) utilizar "ACT_CT" sob SRC_ACT, e) lista bem as informações de localização para "WELL_BASE" como mostrado na Figura 3B, f) lista de volume total de anticorpos (25 ul de tampão + soma de todos os títulos de anticorpos de activação para a coloração única) em "VOL_ACT". Transferir 25 mL de tampão de T-Cell FM3. Consulte a Tabela 1 para testes 1-3, g) Utilize a "SPL_TUBES_1" (ver 3.2.10) para "DEST_MACT", e h) lista também informações de localização para "WELL_MACT", como mostrado na Figura 8.
Nota: Os passos seguintes 3.2.8-3.2.15 irá programar o método para fazer "Mestre Antibody Cocktail" - Abra um novo método (Figura 7).
- Arraste o "Instrícone umento de configuração "para o novo método (Figura 7).
- No campo de especificação de "Configuração do Instrumento", arraste ícones para dicas P1000, dois "SmallTuberack_microfugetubes", e "BiocisionCoolRack_XT" para o diagrama deck. Abra a caixa de diálogo para os dois "SmallTuberack_microfugetubes" e nome como "BASE_CT" e "ACT_CT", respectivamente, conforme especificado no 3.1.17. Abra a caixa de diálogo para "BiocisionCoolRack_XT" e nome como "SPL_TUBES_1", conforme especificado no 3.2.7 (Figura 9).
- Adicionar um novo "Grupo" ao arrastar um ícone "Grupo" ao método (Figura 7).
- Arraste o ícone "Transferência de Arquivo" diretamente abaixo do ícone do "Grupo" transferir "Cocktail Base" para fazer "Mestre Antibody Cocktail" (Figura 7).
- No campo de especificação de "Transferência de Arquivo", selecione as dicas P1000 em uso, seleitos "descarregá-los" quando a transferência é feita, e verificar "Alterar dicas entre as transferências".
- No campo de especificação de "Transferência de Arquivo", selecione o arquivo "AB_MACT" (Tabela 7) pela navegação, marque a opção "File tem uma linha de cabeçalho". Selecione "SRC_BASE" para a posição de origem laboratorial e "WELL_BASE" para obter informações bem no material de laboratório de origem, selecione "DEST_MACT" para o material de laboratório de destino e "WELL_MACT" para obter informações bem no material de laboratório de destino, e selecione "VOL_BASE" para obter informações de volume (Figura 10). Escolheu técnica de transferência adequado para dicas P1000.
Nota: LLS pode não ser necessário para este processo. - Adicionar outro "Transferência de Arquivo", arrastando-o diretamente abaixo "Grupo" para transferir o "Cocktail Activation" que está a ser misturado com o "Cocktail Base" para fazer "Mestre Antibody Cocktail" (Figura 7 </ Strong>). Da mesma forma configurar a etapa de transferência como em 3.2.13 e 3.2.14. Excepções são as seguintes: a) Selecione "SRC_ACT" para a posição de fonte de material de laboratório, b) "WELL_ACT" para obter informações bem no material de laboratório de origem e, c) "VOL_ACT" para obter informações volume.
4. Procedimento Operacional
- Primeiro, dê um duplo clique no ícone do software para o lançamento do leitor de código de barras 2D no computador.
- Em seguida, dê um duplo clique no ícone do software para iniciar o manipulador de líquidos automatizado no computador.
- Em "Instrumento", selecione "Home todos os eixos" para seringas principais do manipulador de líquidos automatizado. Certifique-se de todas as seringas não contêm bolhas de ar visíveis.
Nota: "Home todos os eixos" também dará o instrumento um ponto de referência a partir do qual a fazer movimentos subsequentes. - Abra o método para fazer o "cocktail Base" e o "cocktail Activação" (Figura 2) no software para o ummanipulador de líquidos utomated.
- Colocar os tubos de microcentrífuga em "SmallTuberack_microfugetubes" para "BASE_CT" e "ACT_CT" de acordo com o número de "cocktail base" e "cocktail Activação" a ser feito (figura 3). Em seguida, colocá-los no convés de acordo com a "Configuração do Instrumento" (Figura 5).
- Colocar o reservatório com tampão no convés de acordo com a "Configuração do instrumento".
- De-cap tubos de código de barras 2D contendo os anticorpos utilizando uma tampa de rosca tapador de 8 canais. Mantenha as tampas na ordem exata em uma bandeja com tampa, a fim de evitar a contaminação cruzada. Coloque a "Matrix_OneML_TubeRack" no convés de acordo com a "Configuração do instrumento" (Figura 5).
- Dicas lugar P50 LLS filtrados, P200 LLS dicas filtradas, e dicas P1000 no convés de acordo com a "Configuração do Instrumento" (Figura 5).
- Comece o método clicando no tri verdeem forma de ângulo ícone de início. Conforme solicitado pela janela pop-up, certifique-se que todos os itens na plataforma coincidir com a "Configuração do Instrumento", tal como definido no método. Não coloque quaisquer objectos que não estão listados na seção "Configuração do Instrumento" no deck, pois isso poderia esmagar o pod e / ou a garra. Pressione "OK" para prosseguir.
- Depois do "Matrix_OneML_TubeRack" é movido para o leitor de código de barras 2D e códigos de barras são lidos, uma outra janela pop-up irá perguntar se todos os códigos de barras são lidos. Prossiga pressionando "OK", uma vez confirmada.
- Após a conclusão da transferência por parte do manipulador de líquidos automatizado, recapitular os tubos com código de barras 2D utilizando uma tampa de rosca tapador de 8 canais, e colocá-los de volta para 4 ° C.
- Vortex todos os tubos de microcentrífuga vigorosamente por 20 segundos, e devolvê-los nas prateleiras de tubos.
Nota: vórtex insuficiente pode resultar em sub-óptima de coloração de células. - Feche o método para fazer "Cocktail Base" e "Cocktail Activation". Em seguida, abra o método para fazer "Mestre Antibody Cocktail".
- Configurar 5 ml tubos de poliestireno pré-rotulados de fundo redondo na "BiocisionCoolRack_XT" (Figura 8) e colocá-lo no convés. As etiquetas devem indicar o que "Cocktail Base" e "Cocktail ativação" são misturados, bem como a identificação do paciente adequada.
- Coloque suportes de tubos para "Cocktail Base", "Cocktail de ativação", e dicas P1000 no convés (Figura 9). Inicie o método (Figura 7). Conforme solicitado pela janela pop-up, certifique-se de que os itens da configuração Instrumental jogo baralho no método (Figura 9). Pressione "OK" para prosseguir.
- Quando o processo anterior é feito, adicionar manualmente 50 pi de amostras de sangue em cada 5 ml de tubos de poliestireno de fundo redondo que contém o cocktail de anticorpos.
- tubos de amostra vórtice dentro de um armário de segurança biológica de Classe II e incubar 15 min à temperatura ambiente no escuro. Take o cuidado de evitar estrias sangue nos lados dos tubos, como isto resultará na coloração inconsistente. Remova cuidadosamente quaisquer manchas de sangue por zaragatoas de algodão humedecido com tampão de lavagem de fluxo.
- Adicionar 1 ml de tampão de lise de RBC manualmente e incubar 15 min à temperatura ambiente no escuro.
- Adicionar 2 ml de tampão de lavagem de fluxo (0,1% de azida de sódio, 1% de BSA, 10 U / ml de heparina em 1X HBSS) e centrifuga-se durante 5 min a 400 x g. Elimine o sobrenadante dentro de uma cabine de segurança biológica Classe II. Repita este processo de lavagem. Re-suspender as células coradas em 0,5 ml de tampão de lavagem de fluxo.
- Configurar um citômetro de fluxo que está equipado com lasers de farinha e filtros apropriados, bem como os modelos são executados usando 5 ml tubos de poliestireno de fundo redondo. Use métodos de calibração e compensação de fluorescência citómetro padrão para coleta de dados 12,15. Recolha todos os parâmetros listados em "fluoróforo" na Tabela 1.
Nota: materiais de controlo adequados devem ser usados em cada corrida para garantir ass adequadadesempenho ay. - Depois de amostras em execução, a exportação adquiridos dados como arquivos de FCS.
- Analisar dados usando o software apropriado. Identificar subpopulações de células T utilizando uma estratégia de gating delineado pelo Projeto Imunologia Humana 1.
Representative Results
O objetivo de toda a imunofenotipagem do sangue é obter quantitativa (o delineamento de subconjuntos de células imunes) e informação qualitativa (detecção de status de ativação) em células do sistema imunológico. Temos ligeiramente modificada do painel imunofenotipagem de células T proposto pelo Projeto de Imunologia Humana 1 a melhorar o desempenho geral do nosso método (Tabela 1). O nosso painel de células T tem como objetivo identificar naïve, a memória central (CM), memória efetoras (EM), e as células T efetoras. Resumidamente, que discrimina dupletos baseado em FCS-A e FCS-H. Em seguida, no portão linfócitos com base em dispersão lateral e os níveis de CD45. As células T são então identificados através da expressão de CD3. As células T CD3 + são diferenciadas em células T e células T γδ ap. células T αβ são divididos em células CD4 + e CD8 +. As células T CD4 + e CD8 + são então analisadas para os seus subgrupos com base na expression de CD45RA e CCR7: CD45RA - CCR7 + CM, CD45RA + CCR7 + Naïve, CD45RA + CCR7 - efetoras e CD45RA - CCR7 - células T EM 1. Além disso, nós também acompanhar a sua expressão de marcadores de ativação, tais como CD38, HLA-DR, ICOS, PD-1, GITR, 4-1BB, CD69, NKG2D e OX40 obter informação qualitativa.
Para demonstrar a precisão deste método, foram coradas amostras de sangue total periférico a partir de 4 dadores saudáveis, 5 vezes por dia. A Figura 11 mostra a relação entre a percentagem subpopulação de células T em linfócitos e percentagem do coeficiente de variação (% CV). Uma análise detalhada de subpopulações de células T por cento em linfócitos e% CV para cada subconjunto é apresentado na Tabela 8. Os dados de testes 2 e 3 não estão incluídos na Figura 11 e Tabela 8 para simplificar. Menos de 25% CVentre run (precisão inter-ensaio) foi sugerido por critérios de aceitação para ensaios de biomarcadores fenotípicas para utilização em investigação 10. Todas as medições encontrou este critério, exceto as células ICOS + γδ T (26,64-46,39%. Tabela 8) e células ICOS + T CD8 (14,64-58,39%. Tabela 8). Estes valores são apresentados para fins de demonstração. Não utilizar estas medições porque ICOS desempenha sobretudo um papel importante na activação de células T CD4 16. A tendência de maior CV% em populações que compõem uma porcentagem baixa para a população total foi observado por outros 7. Em investigadores de casos estão interessados em monitorar raros-eventos, o número de células examinadas precisa ser aumentado, a fim de superar a maior imprecisão 17. Juntos, os nossos dados mostram o êxito da implantação da automação na preparação de amostras de toda a imunofenotipagem sangue.
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Figura 1. Fluxo de trabalho para imunofenotipagem com sangue total periférico. Passo a passo do fluxo de trabalho de ensaio imunofenotípicas é mostrado. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. Visão geral do método para fazer "Cocktail Base" e "Cocktail Activation". Etapas do método para fazer "Cocktail Base" e "Cocktail Activation" no software para o manipulador de líquidos automatizado são apresentados. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Figura 3. Disposição para o suporte de tubos com BACE_CT e ACT_CT. (A) mostra layout para o suporte de tubos "BACE_CT". (B) mostra layout para o suporte de tubos "ACT_CT". Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4. definição laboratorial para o suporte de tubos com tubos de código de barras 2D. Passo a passo processo de definição do suporte de tubos com tubos de código de barras 2D. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Figura 5. A configuração do instrumento para o método para fazer "Cocktail Base" e "Cocktail Activation". Ele mostra o layout da plataforma para o método para fazer "Cocktail Base" e "Cocktail Activation". Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6. Instalação para "Criar conjunto de dados". Ele mostra a definição detalhada para "Criar conjunto de dados". Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figu re 7. Visão geral do método para fazer "Mestre Antibody Cocktail". Etapas do método para fazer "Mestre Antibody Cocktail" no software para o manipulador de líquidos automatizado é mostrado. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 8. layout para o suporte de tubos com 5 ml tubos de poliestireno de fundo redondo. Ele mostra layout para o suporte de tubos "SPL_TUBES_1". FM3 significa fluorescência menos 3 (brilhante violeta 421, ficoeritrina e aloficocianina). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Figura 9. A configuração do instrumento para o método para fazer "Mestre Antibody Cocktail". Ele mostra o layout da plataforma para o método para fazer "Mestre Antibody Cocktail". Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 10. Configuração de "Transferência de Arquivo". Ele mostra a definição detalhada de "Transferência de Arquivo". Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 11. Baixa vari capacidade total imunofenotipagem sangue semi-automatizado. valores de CV individuais de todas as populações celulares analisados a partir de quatro dadores saudáveis são mostrados como círculo aberto azul. curva de regressão é mostrado na linha azul. Red linhas pontilhadas indicam 95% bandas confiantes e ganância linhas pontilhadas mostram 95% bandas de previsão. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 12. Um exemplo de coloração subóptima. A coloração foi realizada com agitação em vórtex adequada ou inadequada dos tubos de microcentrífuga de "BACE_CT" e "ACT_CT". Existem duas populações fechado em B. A população menor com coloração CD45 fraca representa células que não recebem coloração ideal.g12large.jpg "target =" _ blank "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| GRUPO | MARCADOR | fluoróforo | Clone | Titulação (mL / coloração) | |
| COCKTAIL BASE | TCELL | CD45 | FITC | 2D1 | 0,4 |
| CD3 | Alexa700 | UCHT1 | 1 | ||
| CD8 | APC-H7 | SK1 | 0,4 | ||
| CD4 | PerCP-Cy5.5 | SK3 | 2 | ||
| CCR7 | PE-CF594 | 150503 | 1 | ||
| CD45RA | PE-Cy7 | L48 | 1 | ||
| TCRab | BV786 </ Td> | T10B9.1A-31 | 1 | ||
| TCRgd | BV650 | B1 | 5 | ||
| ATIVAÇÃO COCKTAIL-1 | TEST1 | HLA-DR | BV421 | G46-6 | 5 |
| CD278 (ICOS) | PE | DX29 | 5 | ||
| CD38 | APC | HB7 | 1 | ||
| ATIVAÇÃO COCKTAIL-2 | TEST2 | CD279 (PD1) | BV421 | EH12.1 | 2.5 |
| CD357 (GITR) | PE | eBioAITR | 5 | ||
| CD137 (41BB) | APC | 4B4-1 | 10 | ||
| ATIVAÇÃO COCKTAIL-3 | TEST3 | CD69 | BV421 | FN50 | 1 </ Td> |
| CD314 (NKG2D) | PE | 1D11 | 2 | ||
| CD134 (OX40) | APC | ACT35 | 5 |
Tabela 1. Uma lista de anticorpos para o painel de células T modificadas.
| AB | BC |
| CD45_FITC | 0163562388 |
| CD3_Alexa700 | 0163562110 |
| CD4_PerCP_CY5.5 | 0163562364 |
| CD8_APC-H7 | 0163562363 |
| CCR7_PE-CF594 | 0163562387 |
| CD45RA_PE-Cy7 | 0163562091 |
| TCRab_BV786 | 0163562069 |
| TCRgd_BV650 | 0163562108 |
| 0163562339 | |
| A_CD278 (ICOS) _PE | 0163562082 |
| A_CD38_APC | 0163562317 |
| A_CD279 (PD1) _BV421 | 0163562340 |
| A_CD357 (GITR) _PE | 0163562093 |
| A_CD137 (41BB) _APC | 0163562315 |
| A_CD69_BV421 | 0163562341 |
| A_CD314 (NKG2D) _PE | 0163562314 |
| A_CD134 (OX40) _APC | 0163562316 |
Tabela 2. nomes de anticorpos com números de código de barras 2D.
| GRUPO | WELL_BASE | AB_NAME | VOL |
| TCELL | 1 | 7.2 | |
| TCELL | 1 | CD45_FITC | 7.2 |
| TCELL | 1 | CD3_Alexa700 | 18 |
| TCELL | 1 | CCR7_PE-CF594 | 18 |
| TCELL | 1 | CD45RA_PE-Cy7 | 18 |
| TCELL | 1 | TCRab_BV786 | 18 |
Tabela 3. Um arquivo "BASE_CT_P50": nomes de anticorpos e informações de volume.
| GRUPO | WELL_BASE | AB_NAME | VOL |
| TCELL 1 | CD4_PerCP_CY5.5 | 36 | |
| TCELL | 1 | TCRgd_BV650 | 90 |
Tabela 4. Um arquivo "BASE_CT_P200": nomes de anticorpos e informações de volume.
| GRUPO | WELL_ACT | AB_NAME | VOL |
| TEST1 | 7 | A_HLA-DR_BV421 | 30 |
| TEST1 | 7 | A_CD278 (ICOS) _PE | 30 |
| TEST1 | 7 | A_CD38_APC | 6 |
| TEST2 | 13 | A_CD279 (PD1) _BV421 | 15 |
| TEST2 | 13 | A_CD357 (GITR) _PE | 30 |
| TEST3 | 19 | A_CD314 (NKG2D) _PE | 12 |
| TEST3 | 19 | A_CD69_BV421 | 6 |
| TEST3 | 19 | A_CD134 (OX40) _APC | 30 |
Tabela 5. Um arquivo "ACT_ CT_P50": nomes de anticorpos e informações de volume.
| GRUPO | WELL_ACT | AB_NAME | VOL |
| TEST2 | 13 | A_CD137 (41BB) _APC | 60 |
Tabela 6. Um arquivo "ACT_CT _P200": nomes de anticorpos e informações de volume.
| DOADOR# | SRC_ BASE | COCKTAIL BASE | BEM_ BASE | VOL_ BASE | SRC_ACT | dades vação COCKTAIL | BEM_ AJA | VOL_ACT | DEST_MACT | BEM_ MACT | |
| HD001 | BASE_CT | TCELL | 1 | 36,8 | ACT_CT | FM3 | 1 | 25 | SPL_TUBES_1 1 | ||
| HD001 | BASE_CT | TCELL | 1 | 36,8 | ACT_CT | TEST1 | 7 | 36 | SPL_TUBES_1 | 7 | |
| HD001 | BASE_CT | TCELL | 1 | 36,8 | ACT_CT | TEST2 | 13 | 42,5 | SPL_TUBES_1 | 13 | |
| HD001 | BASE_CT | TCELL | 1 | 36,8 | ACT_CT | TEST3 | 19 | 33 | SPL_TUBES_1 | 19 | |
| HD002 | BASE_CT | TCELL | 1 | 36,8 | ACT_CT | FM3 | 1 | 25 | SPL_TUBES_1 | 2 | |
| HD002 | BASE_CT | TCELL | 1 | 36,8 | TEST1 | 7 | 36 | SPL_TUBES_1 | 8 | ||
| HD002 | BASE_CT | TCELL | 1 | 36,8 | ACT_CT | TEST2 | 13 | 42,5 | SPL_TUBES_1 | 14 | |
| HD002 | BASE_CT | TCELL | 1 | 36,8 | ACT_CT | TEST3 | 19 | 33 | SPL_TUBES_1 | 20 | |
| HD003 | BASE_CT | TCELL | 1 | 36,8 | ACT_CT | FM3 | 1 | 25 | SPL_TUBES_1 | 3 | |
| HD003 | BASE_CT | TCELL | 1 | 36,8 | ACT_CT | TEST1 | 7 | 36 | SPL_TUBES_1 | 9 | BASE_CT | TCELL | 1 | 36,8 | ACT_CT | TEST2 | 13 | 42,5 | SPL_TUBES_1 | 15 |
| HD003 | BASE_CT | TCELL | 1 | 36,8 | ACT_CT | TEST3 | 19 | 33 | SPL_TUBES_1 | 21 | |
| HD004 | BASE_CT | TCELL | 1 | 36,8 | ACT_CT | FM3 | 1 | 25 | SPL_TUBES_1 | 4 | |
| HD004 | BASE_CT | TCELL | 1 | 36,8 | ACT_CT | TEST1 | 7 | 36 | SPL_TUBES_1 | 10 | |
| HD004 | BASE_CT | TCELL | 1 | 36,8 | ACT_CT | TEST2 13 | 42,5 | SPL_TUBES_1 | 16 | ||
| HD004 | BASE_CT | TCELL | 1 | 36,8 | ACT_CT | TEST3 | 19 | 33 | SPL_TUBES_1 | 22 | |
Tabela 7. Um arquivo "AB_MACT": Fonte e informações de destino para "Mestre Antibody Cocktail".
| População # na Fig. 1 | Eu | ii | iii | iv | v | |
| nome população | CD3 + | células T ab | células T gd | CD3 + CD4 + | CD3 + CD8 + | |
| % De linfócitos </ Td> | Heathly Dador # 1 | 79.80 | 75,20 | 2.70 | 49.60 | 22.30 |
| Heathly Dador # 2 | 69,40 | 61.90 | 5.85 | 44.40 | 16.20 | |
| Heathly Dador # 3 | 75.80 | 69.60 | 4.75 | 42.00 | 23.50 | |
| Heathly Dador # 4 | 77,20 | 73.50 | 1,98 | 52.70 | 18.90 | |
| %CV | Heathly Dador # 1 | 1,42 | 1.58 | 3.70 | 2.50 | 1,56 |
| Heathly Dador # 2 | 2.48 | 2.39 | 5,74 | 2,82 | 2.41 | |
| Heathly Dador # 3 | 1.15 | 1,40 | 6,32 | 1,42 | 2,72 | |
| Heathly Dador # 4 | 0,81 | 0,94 | 5.45 | 1.20 | 1,44 | |
| Média | 1,47 | 1.58 | 5.30 | 1.99 | 2.03 | |
| Desvio padrão | 0,72 | 0,61 | 1.13 | 0,79 | 0,63 |
Tabela 8. Os dados em bruto para% de linfócitos e% CV para cada subconjunto representados graficamente na Figura 4. Note-se que os dados para os testes 2 e 3 não são mostrados na Figura 5 e na Tabela 8, para simplificar a apresentação dos dados.
Discussion
Imunofenotipagem de sangue periférico é criticamente importante para a obtenção de insights sobre as respostas individuais à imunoterapia. O desafio reside na normalização ensaio para controlar a variabilidade 1,14 experimento-a-experiência. Uma fonte principal de variabilidade reside na manipulação humana de amostras. Portanto, é concebível que a automatização completa ou parcial do processamento da amostra irá facilitar uma redução dramática na variabilidade 1,14 experimento-a-experimento. Neste protocolo, relatamos o nosso bem-sucedido esforço para minimizar a variabilidade do ensaio através da introdução de um manipulador de líquidos automatizado equipado com leitor de código de barras 2D para a coloração da amostra total imunofenotipagem sangue.
No design, o nosso método é versátil e pode monitorar outros subconjuntos imunes, acrescentando adicionais "Cocktails base" para defini-los. Tais subgrupos incluem células T auxiliares, células T reguladoras, células B, células NK, células dendríticas e monócitos (manuscrito empreparação) 18. Nós adaptamos painéis de anticorpos recomendados pelo consórcio através da introdução de marcadores adicionais 1. populações celulares foram identificados utilizando "cocktail Base" conjugados com fluorocromos com emissões mínimas para o brilhante violeta 421 (BV421), ficoeritrina (PE), e aloficocianina (APC) detectores, como queríamos para reservar estes canais para a detecção de antigénios induzíveis. Esta característica não só garante a mais alta sensibilidade para monitorar o status de ativação de células imunes, mas também permite acomodação flexível de novos marcadores de ativação, como estes três fluorocromos são mais frequentemente conjugada com anticorpos contra marcadores induzíveis. Por isso, o nosso método não só é adequado para a preparação de cocktail para toda a imunofenotipagem de sangue, mas também é útil para a coloração de outras amostras, incluindo células mononucleares de sangue periférico e as células recuperadas a partir de tecidos de desagregação (por exemplo, tumor).
introdução bem sucedidadução do nosso método requer uma atenção especial aos passos na preparação laboratorial e de programação e execução do método. Preparação dos tubos de código de barras 2D inclui rotulagem com rótulos legíveis por humanos e transferência dos anticorpos aos tubos designados. Para evitar a introdução de erros, recomendamos fazer isso com duas pessoas. Sempre mudando planilhas, os investigadores devem verificar se o método funciona corretamente. Escolher métodos de pipetagem adequadas durante a programação garante a transferência líquida de sucesso. LLS permite pipetagem sem receber detritos precipitou a partir do fundo de tubos de anticorpos, para o qual usamos tanto P50 ou P200 dicas condutores. LLS pode não ser uma boa opção para dicas P1000 como LLS é mais sensível com dicas P1000 e às vezes falsamente desencadeada pela presença de bolhas. Heights em definição material de laboratório deve ser ajustada para cada instrumento de transferência de líquido como sub-óptima poderia ocorrer, por exemplo, se não houver espaço suficiente entre a borda de dicase a parte inferior de tubos. Como mostrado na Figura 12, se o "cocktail Base" e / ou "cocktail Activação" não são bem agitadas, pode resultar em sub-óptima de coloração.
Nós pensamos sobre o uso de reagentes liofilizados para a coloração de células como uma abordagem alternativa para reduzir a variabilidade relacionada com o reagente de distribuição 19. No entanto, os conjugados de polímero de corantes violeta brilhante são conhecidos por interagir uns com os outros que provoquem sinais não específicos. Como tal, a adição de mais do que dois conjugados de polímero (por exemplo, BV421 e BV650 etc.) em reagentes liof ilizados podem causar sinalização não-específica (por exemplo, aumento do sinal de fundo no BV650 BV421 + população) 20. Além disso, reagentes liofilizados carecem de flexibilidade para a inclusão de nova coloração. Eles são geralmente mais caros e exigem uma ordem de maioria. Por essas razões, optamos por utilizar o manipulador de líquidos automatizado equipado com tubos de código de barras 2D. Embora tflocos tempo para configurar e implica um investimento inicial para comprar o instrumento, no longo prazo, tais fatores serão compensadas pelo aumento da produtividade e reprodutibilidade dos ensaios. Na verdade, alguns grupos previamente relatado a integração bem sucedida do manipulador de líquidos automatizado em seu fluxo de trabalho de imunofenotipagem ou aplicações semelhantes 21,22. soluções automatizadas para análise de citometria de fluxo também estão disponíveis a partir de fontes comerciais (FACS SPA III, Cocktail Automated Preparação de estação de trabalho, e FlowStainer). Isto indica ainda existe uma grande necessidade de uma preparação de cocktail automatizado para imunofenotipagem.
Depois de dominar esta técnica, nós prevemos que o desenvolvimento de totalmente automatizado imunofenotipagem sangue total irá reduzir ainda mais variabilidade experimento-a-experiência e pode fazer toda a imunofenotipagem do sangue viável, mesmo em um ensaio clínico multicêntrico ajuste 23. Nós já começaram usando uma lise foih assistente para automatizar os passos de lise e de lavagem. Nós também prevêem que a determinação automatizada do volume de anticorpo nos tubos de código de barras 2D e o acompanhamento de distribuição do reagente melhorará grandemente inventário de anticorpos e o controlo de qualidade sobre o nosso método, respectivamente.
Disclosures
YK, ILG, TLM, WLM, DPH e KSB: Não há concorrentes interesses financeiros. ANT é um funcionário da Beckman Coulter, Inc. publicação deste artigo vídeo é patrocinado pela Beckman Coulter, Inc.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BD LSRFortessa | BD Biosciences | Flow cytometer | |
| NXp Span-8 Laboratory Automation Workstation | Beckman Coulter | A31839 | Laboratory Automation Workstation |
| Insert, Tube, 11 mm, White, for 1.5 ml Microfuge Tubes (case of 25) | Beckman Coulter | 373696 | Accessary for 24-Position Tube Rack to accommodate microfuge tubes. |
| LLS kit | Beckman Coulter | 719262 | Attach bottom of the deck in Laboratory Automation Workstation to enable liquid level sensing |
| 24-Position Tube Rack | Beckman Coulter | 373661 | Tube rack to hold microfuge tubes for antibody cocktails or blood |
| BIOHAZARD AUTOCLAVE BAGS 12 x 24 INCHES RED | LabMart | M111416 | Disposable autoclave bags for the Laboratory Automation Workstation |
| VisionMate High Speed 2D Barcode Reader | Thermo Scientific | AB-1850 | 2D barcode reader |
| 8-Channel Handheld Screw Cap Capper/Decapper | Thermo Scientific | 4105MAT | For de-capping and capping 2D barcode tubes |
| Microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | 02-681-335 | For making cocktail in or supplying blood speciment to the Laboratory Automation Workstation |
| CoolRack XT CFT24 | biocision | BCS-534 | To hold sample tubes. |
| 1.0 ml Matrix ScrewTop Amber Tubes in Latch Racks | Thermo Scientific | 3741AMB | 2D barcode tubes to store fluorescent dye-cojugated antibodies |
| Biomek Span-8 P1000 Tips, Conductive, Pre-sterile with Barrier, 1,025 µl | Beckman Coulter | 987925 | Tips for Laboratory Automation Workstation |
| Biomek Span-8 P50 Tips, Conductive, Pre-sterile with Barrier, 50 µl (Case of 10 racks) | Beckman Coulter | B01091 | Tips for Laboratory Automation Workstation |
| Biomek Span-8 P250 Tips, Conductive, Pre-sterile with Barrier (Case of 10 racks) | Beckman Coulter | 394627 | Tips for Laboratory Automation Workstation |
| BD FACS Lysing Solution 10x Concentrate | BD Biosciences | 349202 | RBC lysis |
| Falcon Round-Bottom Polystyrene Tubes | Fisher Scientific | 14-959-5 | Sample tubes |
| Anti-CD45 FITC | BD Biosciences | 347463 | Effector T cell panel (base) |
| Anti-CD3 Alexa Fluor 700 | eBioscience | 56-0038-42 | Effector T cell panel (base) |
| Anti-CD4 PerCPCy5.5 | BD Biosciences | 341654 | Effector T cell panel (base) |
| Anti-TCRgd BV650 | BD Biosciences | 564156 | Effector T cell panel (base) |
| Anti-TCRab BV786 | BD Biosciences | 563825 | Effector T cell panel (base) |
| Anti-CD8 APC-H7 | BD Biosciences | 560179 | Effector T cell panel (base) |
| Anti-CCR7 PE-CF594 | BD Biosciences | 562381 | Effector T cell panel (base) |
| Anti-CD45RA PE-Cy7 | BD Biosciences | 337167 | Effector T cell panel (base) |
| Anti-HLA-DR BV421 | BD Biosciences | 562804 | Effector T cell panel (activation) |
| Anti-CD278(ICOS) PE | BD Biosciences | 557802 | Effector T cell panel (activation) |
| Anti-CD38 APC | BD Biosciences | 340439 | Effector T cell panel (activation) |
| Anti-CD279(PD1) BV421 | BD Biosciences | 562516 | Effector T cell panel (activation) |
| Anti-CD357(GITR) PE | eBioscience | 12-5875-42 | Effector T cell panel (activation) |
| Anti-CD137(41BB) APC | BD Biosciences | 550890 | Effector T cell panel (activation) |
| Anti-CD69 BV421 | BD Biosciences | 562884 | Effector T cell panel (activation) |
| Anti-CD314(NKG2D) PE | BD Biosciences | 557940 | Effector T cell panel (activation) |
| Anti-CD134(OX40) APC | BioLegend | 350008 | Effector T cell panel (activation) |
| BD Vacutainer Plastic Blood Collection Tubes with Sodium Heparin: Conventional Stopper | Fisher Scientific | 02-689-6 | For collecting blood |
| Albumin, Bovine Serum, Fraction V, RIA and ELISA Grade | EMD Millipore | 126593 | For flow wash buffer |
| Sodium Azide | Sigma-Aldrich | S8032 | For flow wash buffer |
| Heparin, sodium salt | Affimetrix | 16920 | For flow wash buffer |
| Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS), 1x, with Calcium, Magnesium, without Phenol Red | GE Healthcare Life Sciences | SH30588.02 | For flow wash buffer |
References
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