Whole blood Immunophenotyping is indispensable for monitoring the human immune system. However, the number of reagents required and the instability of specific fluorochromes in premixed cocktails necessitates daily reagent preparation. Here we show that semi-automated preparation of staining antibody cocktail helps establish reliable immunophenotyping by minimizing variability in reagent dispensing.
Immunfenotypning av perifert blod genom flöde bestämmer cytometry förändringar i frekvens och aktiveringsstatus av perifera leukocyter under sjukdom och behandling. Den har potential att förutsäga terapeutisk effektivitet och identifiera nya terapeutiska mål. Helblod färgning använder omanipulerat blod, vilket minimerar artefakter som kan uppstå under provberedning. Emellertid måste helblod färgning också göras på nyligen uppsamlat blod för att säkerställa integriteten av provet. Dessutom är det bäst att förbereda cocktails antikropp på samma dag för att undvika potentiell instabilitet tandem-färgämnen och förhindra reagens interaktion mellan lysande violett färgämnen. Därför kräver helblod färgning noggrann standardisering att kontrollera för inom och mellan experimentell variabilitet.
Här rapporterar vi utplacering av en automatiserad vätskehanterare utrustad med en två-dimensionell (2D) streckkodsläsare in i en standardprocess för framställning av Antibody cocktails för flödescytometri. Antikroppar överfördes till 2D streckkodade rör anordnade i en 96-brunnsformat och deras innehåll samlas i en databas. Den flytande hanterare kan sedan lokalisera flaskor källantikropps genom att referera namn antikropps i databasen. Vår metod elimineras tråkiga samordning för placering av rör källa antikroppar. Det gav mångsidighet tillåter användaren att enkelt ändra valfritt antal detaljer i antikroppsfördelningsprocessen såsom specifik antikropp att använda, volym och destination genom att modifiera databasen utan att skriva skript i mjukvarumetod för varje analys.
Ett bevis på konceptet experiment uppnått enastående bland och intra- analysprecision, visat genom upprepad framställning av en 11-färg, 17-antikropp flödescytometri analys. Dessa metoder ökat genomströmning för flödescytometri analyser och underlättas daglig framställning av komplexa drinkar antikropps krävs för detaljerad Fenoltypic karakterisering av nytaget antikoagulerat perifert blod.
Immunfenotypning av humant perifert blod bestämmer kvantitativa och kvalitativa förändringar i immuncellundergrupper 1. Det ger en inblick i verkningsmekanismer och motstånd, hjälpmedel upptäckten av prediktiva biomarkörer, och underlättar utvecklingen av kombiimmunterapier. Därför är validering och standardisering av immunfenotypning ett område av stort intresse för akademiska forskare, kliniska laboratorier och industrier.
Även immunfenotypning av perifert blod genom flödescytometriska metoder används för närvarande för klinisk behandling av hematologiska maligniteter 2,3 och humant immunbristvirus (HIV) infektion 4,5, tillförlitlig immunfenotypning av perifert blod för immunterapi kräver särskilda överväganden vid validering och standardisering, eftersom det kräver mer omfattande täckning över immuncellundergrupper och aktiverings / hämmande receptorer 1,6-8. Succéssful immunfenotypning kräver noggrann standardisering för att minimera experiment till experiment variationen i samband med instrument inställning och cellfärgningsproceduren 9,10. Medan standardisering av instrumentinställningar för flödescytometri är väl etablerad att ta itu med tidigare oro 9,11,12, är det fortfarande oklart hur man minimera variabiliteten i samband med cellfärgning utan att begränsa omfattningen av immuncellundergrupper och deras aktiveringsstatus.
Eftersom antalet antigener som skall detekteras ökar, ökar också möjligheten för fel och variationer på grund av suboptimal reagensdispensering och korskontaminering. Metoder för phenoptypic analys av antikoagulerat helblod fastställdes i slutet av 1980-talet för användning i kliniska laboratorieanalyser. Samma metoder tillgodose behoven hos forskningslaboratorium för provberedning. Viktigare, drinkar antikropp som används i det kliniska laboratoriet är typiskt mindre komplexa och available pre-titrerades och förblandas från tillverkaren. Endast en enda överföring av den förblandade antikroppscocktail krävs. I inställningen forskning, antikropps cocktails av 10-16-antikroppar är typiska. Varje cocktail måste valideras för stabilitet av laboratoriet eller beredda färska före varje analys. Förbereda flera drinkar antikropps för ett prov kan medföra pipettering av 50-80 individuella antikroppar, en uppgift som är både tråkiga och felbenägen.
Automatisering av cocktail förberedelse har flera fördelar jämfört med manuell cocktail beredning, såsom färre fel, ökad noggrannhet pipettering, och kanske till och med minskad reagens slöseri. Här rapporterar vi det framgångsrika införandet av ett automatiserat vätske hanterare utrustad med en tvådimensionell (2D) streckkodsläsare i cellfärgningsprocessen av immunfenotypning att minimera variabiliteten i samband med provberedning.
Immunfenotypning av perifert blod är av avgörande betydelse för att få inblick i enskilda svar på immunterapi. Utmaningen ligger i analys standardisering för att styra experiment till experiment variationen 1,14. En huvudsaklig källa till variabilitet ligger i den mänskliga manipulering av prover. Därför är det tänkbart att partiell eller fullständig automatisering av provbehandling kommer att underlätta en dramatisk minskning av experiment till experiment variationen 1,14. I detta protokoll, rapporterar vi vår framgångsrika försök att minimera analysvariation genom att införa en automatiserad flytande hanterare utrustad med 2D streckkodsläsare för provfärgning i helblod immunfenotypning.
Design, är vår metod mångsidig och kan övervaka andra immunundergrupper genom att lägga till ytterligare "Base Cocktails" för att definiera dem. Sådana undergrupper innefattar T-hjälparceller, T regulatoriska celler, B-celler, NK-celler, dendritiska celler och monocyter (manuskript ipreparat) 18. Vi anpassade konsortiets rekommenderade paneler antikropps genom att införa ytterligare markörer 1. Cellpopulationer identifierades med hjälp av "Base Cocktail" konjugerad till fluorokromer med minimal emission i den lysande violett 421 (BV421), fykoerytrin (PE), och allofykocyanin (APC) detektorer, som vi ville att reservera dessa kanaler för detektering av inducerbara antigener. Den här funktionen säkerställer inte bara den högsta känsligheten för att övervaka aktiveringsstatus av immunceller, men möjliggör också flexibelt boende nya aktiveringsmarkörer som dessa tre fluorokromer oftast konjugerade med antikroppar mot inducerbara markörer. Därför är inte bara lämpar sig för cocktail förberedelse för helblod immunfenotypning vår metod, men är också användbar för färgning andra prover inklusive perifera mononukleära blodceller och celler som återvunnits från uppdelade vävnader (t.ex. tumör).
framgångsrik introproduktion av vår metod kräver särskild uppmärksamhet till steg i labb förberedelse, och programmering och utförande av metoden. Framställning av 2D streckrören innefattar märkning med mänskligt läsbar etiketter och överföring av antikroppar mot de utsedda rören. För att förhindra införandet av fel, rekommenderar vi att göra detta med två personer. Närhelst du ändrar kalkylblad, bör utredarna kontrollera om metoden fungerar. Att välja lämpliga pipetteringsmetoder under programmering säkerställer framgångsrik vätskeöverföring. LLS möjliggör pipettering utan att utfällt skräp från botten av rör antikropps som vi använder antingen P50 eller P200 ledande tips. LLS kan inte vara ett bra alternativ för P1000 tips som LLS är känsligare med P1000 tips och ibland felaktigt utlöses av närvaron av bubblor. Höjder i labb definition bör anpassas för varje instrument som suboptimal vätskeöverföring kan förekomma, till exempel om det inte finns tillräckligt utrymme mellan kanten av tipsoch botten av rören. Som visas i figur 12, om "Base Cocktail" och / eller "Activation Cocktail" inte virvlas väl, kan det resultera i suboptimalt färgning.
Vi tänkte använda frystorkade reagens för cellfärgning som ett alternativ för att minska variationen i samband med reagens dispensering 19. Emellertid polymerkonjugat av lysande violett färgämnen kända för att interagera med varandra vilket orsakar icke-specifika signaler. Som sådan, lägga till mer än två polymerkonjugat (t.ex. BV421 och BV650 etc.) i frystorkade reagens kan orsaka icke-specifik signalering (t.ex. ökning av BV650 bakgrundssignal i BV421 + populationen) 20. Dessutom frystorkade reagens saknar flexibilitet för att inkludera nya färgning. De är oftast dyrare och kräver en bulk beställning. Av dessa skäl har vi valt att använda den automatiserade vätskehanterings utrustad med 2D streckrören. Även om det takes tid att ställa upp och innebär en initial investering att köpa instrumentet, i det långa loppet sådana faktorer kommer att kompenseras av ökad produktivitet och reproducerbarhet analyser. I själva verket, några grupper tidigare rapporterade den framgångsrika integrationen av den automatiserade vätskehanterings i sitt arbetsflöde av immunfenotypning eller liknande applikationer 21,22. Automatiserade lösningar för flödescytometrianalys finns också tillgängliga från kommersiella källor (FACS SPA III, Automated Cocktail Förberedelser Workstation och FlowStainer). Detta indikerar vidare att det finns ett stort behov för automatiserad cocktail förberedelse för immunfenotypning.
Efter mastering denna teknik, föreställer vi att utvecklingen av helautomatiska helblod immunfenotypning ytterligare kommer att minska experiment till experiment variabilitet och kan göra helblod immunfenotypning möjlig även i en multi klinisk prövning inställning 23. Vi har redan börjat använda en lys varh assistent att automatisera lys och tvättstegen. Vi föreställer oss också att automatiserad bestämning av volymen av antikroppen i 2D streck rör och spårning av reagensdispensering i hög grad kommer att förbättra inventering av antikroppar och kvalitetskontroll över vår metod, respektive.
The authors have nothing to disclose.
We thank Hannah Puzas for assistance with system design and configuration, and Kevin Khovananth for technical advice. Funding for this work was provided by The Hearst Foundations and the Providence Portland Medical Foundation.
BD LSRFortessa | BD Biosciences | Flow cytometer | |
NXp Span-8 Laboratory Automation Workstation | Beckman Coulter | A31839 | Laboratory Automation Workstation |
Insert, Tube, 11 mm, White, for 1.5 mL Microfuge Tubes (case of 25) | Beckman Coulter | 373696 | Accessary for 24-Position Tube Rack to accommodate microfuge tubes. |
LLS kit | Beckman Coulter | 719262 | Attach bottom of the deck in Laboratory Automation Workstation to enable liquid level sensing |
24-Position Tube Rack | Beckman Coulter | 373661 | Tube rack to hold microfuge tubes for antibody cocktails or blood |
BIOHAZARD AUTOCLAVE BAGS 12×24 IN. RED | LabMart | M111416 | Disposable autoclave bags for the Laboratory Automation Workstation |
VisionMate High Speed 2D Barcode Reader | Thermo Scientific | AB-1850 | 2D barcode reader |
8-Channel Handheld Screw Cap Capper/Decapper | Thermo Scientific | 4105MAT | For de-capping and capping 2D barcode tubes |
Microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | 02-681-335 | For making cocktail in or supplying blood speciment to the Laboratory Automation Workstation |
CoolRack XT CFT24 | biocision | BCS-534 | To hold sample tubes. |
1.0 mL Matrix ScrewTop Amber Tubes in Latch Racks | Thermo Scientific | 3741AMB | 2D barcode tubes to store fluorescent dye-cojugated antibodies |
Biomek Span-8 P1000 Tips, Conductive, Pre-sterile with Barrier, 1025 µL | Beckman Coulter | 987925 | Tips for Laboratory Automation Workstation |
Biomek Span-8 P50 Tips, Conductive, Pre-sterile with Barrier, 50 µL (Case of 10 racks) | Beckman Coulter | B01091 | Tips for Laboratory Automation Workstation |
Biomek Span-8 P250 Tips, Conductive, Pre-sterile with Barrier (Case of 10 racks) | Beckman Coulter | 394627 | Tips for Laboratory Automation Workstation |
BD FACS Lysing Solution 10X Concentrate | BD Biosciences | 349202 | RBC lysis |
Falcon Round-Bottom Polystyrene Tubes | Fisher Scientific | 14-959-5 | Sample tubes |
Anti-CD45 FITC | BD Biosciences | 347463 | Effector T cell panel (base) |
Anti-CD3 Alexa Fluor 700 | eBioscience | 56-0038-42 | Effector T cell panel (base) |
Anti-CD4 PerCPCy5.5 | BD Biosciences | 341654 | Effector T cell panel (base) |
Anti-TCRgd BV650 | BD Biosciences | 564156 | Effector T cell panel (base) |
Anti-TCRab BV786 | BD Biosciences | 563825 | Effector T cell panel (base) |
Anti-CD8 APC-H7 | BD Biosciences | 560179 | Effector T cell panel (base) |
Anti-CCR7 PE-CF594 | BD Biosciences | 562381 | Effector T cell panel (base) |
Anti-CD45RA PE-Cy7 | BD Biosciences | 337167 | Effector T cell panel (base) |
Anti-HLA-DR BV421 | BD Biosciences | 562804 | Effector T cell panel (activation) |
Anti-CD278(ICOS) PE | BD Biosciences | 557802 | Effector T cell panel (activation) |
Anti-CD38 APC | BD Biosciences | 340439 | Effector T cell panel (activation) |
Anti-CD279(PD1) BV421 | BD Biosciences | 562516 | Effector T cell panel (activation) |
Anti-CD357(GITR) PE | eBioscience | 12-5875-42 | Effector T cell panel (activation) |
Anti-CD137(41BB) APC | BD Biosciences | 550890 | Effector T cell panel (activation) |
Anti-CD69 BV421 | BD Biosciences | 562884 | Effector T cell panel (activation) |
Anti-CD314(NKG2D) PE | BD Biosciences | 557940 | Effector T cell panel (activation) |
Anti-CD134(OX40) APC | BioLegend | 350008 | Effector T cell panel (activation) |
BD Vacutainer Plastic Blood Collection Tubes with Sodium Heparin: Conventional Stopper | Fisher Scientific | 02-689-6 | For collecting blood |
Albumin, Bovine Serum, Fraction V, RIA and ELISA Grade | EMD Millipore | 126593 | For flow wash buffer |
Sodium Azide | Sigma-Aldrich | S8032 | For flow wash buffer |
Heparin, sodium salt | Affimetrix | 16920 | For flow wash buffer |
Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS), 1X, with Calcium, Magnesium, without Phenol Red | GE Healthcare Life Sciences | SH30588.02 | For flow wash buffer |