Whole blood Immunophenotyping is indispensable for monitoring the human immune system. However, the number of reagents required and the instability of specific fluorochromes in premixed cocktails necessitates daily reagent preparation. Here we show that semi-automated preparation of staining antibody cocktail helps establish reliable immunophenotyping by minimizing variability in reagent dispensing.
प्रवाह से परिधीय रक्त की Immunophenotyping cytometry रोग और उपचार के दौरान परिधीय ल्यूकोसाइट्स की आवृत्ति और सक्रियण स्थिति में परिवर्तन निर्धारित करता है। यह संभावित चिकित्सीय प्रभावकारिता की भविष्यवाणी और उपन्यास चिकित्सकीय लक्ष्यों की पहचान करने के लिए है। पूरे रक्त धुंधला unmanipulated खून है, जो कि कलाकृतियों नमूना तैयार करने के दौरान हो सकता है कम से कम इस्तेमाल करता है। हालांकि, पूरे रक्त धुंधला भी हौसले से एकत्र रक्त पर किया जाना चाहिए नमूना की अखंडता को सुनिश्चित करने के लिए। इसके अतिरिक्त, यह एक ही दिन में एंटीबॉडी कॉकटेल तैयार करने के लिए मिलकर-रंगों के संभावित अस्थिरता से बचने और शानदार बैंगनी रंगों के बीच अभिकर्मक बातचीत को रोकने के लिए सबसे अच्छा है। इसलिए, पूरे रक्त धुंधला अंतर और अंतर-प्रयोगात्मक परिवर्तनशीलता के लिए नियंत्रित करने के लिए सावधान मानकीकरण की आवश्यकता है।
यहाँ, हम antibod बनाने का एक मानक प्रक्रिया में एक दो आयामी (2 डी) बारकोड रीडर के साथ सुसज्जित एक स्वचालित तरल हैंडलर की तैनाती की रिपोर्टसे फ्लो के लिए y कॉकटेल। 2 डी बारकोड वाले एंटीबॉडी एक साथ 96 प्रारूप और उनकी सामग्री एक डेटाबेस में संकलित में व्यवस्था की ट्यूबों में स्थानांतरित कर दिया गया। तरल हैंडलर तो डेटाबेस के भीतर एंटीबॉडी के नाम संदर्भित द्वारा स्रोत एंटीबॉडी शीशियों का पता लगाने सकता है। हमारे विधि स्रोत एंटीबॉडी ट्यूब की स्थिति के लिए थकाऊ समन्वय सफाया कर दिया। यह उपयोगकर्ता आसानी से प्रत्येक परख के लिए सॉफ्टवेयर विधि में पटकथा को फिर से लिखना के बिना डेटाबेस को संशोधित करके इस तरह के उपयोग के लिए विशिष्ट एंटीबॉडी, मात्रा, और गंतव्य के रूप में एंटीबॉडी वितरण प्रक्रिया में विवरण के किसी भी संख्या को बदलने की अनुमति बहुमुखी प्रतिभा प्रदान की है।
अवधारणा प्रयोग का एक सबूत बकाया अंतर और अंतर परख सटीक, परख cytometry एक 11-रंग, 17-एंटीबॉडी के प्रवाह को दोहराने की तैयारी द्वारा प्रदर्शन हासिल की। इन तरीकों assays के प्रवाह cytometry के लिए समग्र throughput वृद्धि हुई है और विस्तृत pheno के लिए आवश्यक जटिल एंटीबॉडी कॉकटेल की तैयारी में मदद की दैनिकहौसले से एकत्र anticoagulated परिधीय रक्त की िटिपक विशेषता।
मानव परिधीय रक्त की Immunophenotyping प्रतिरक्षा सेल सबसेट 1 में मात्रात्मक और गुणात्मक परिवर्तन निर्धारित करता है। यह कार्रवाई और प्रतिरोध, भविष्य कहनेवाला बायोमार्कर की खोज एड्स के तंत्र में अंतर्दृष्टि प्रदान करता है, और संयोजन immunotherapies के विकास की सुविधा। इसलिए, सत्यापन और immunophenotyping के मानकीकरण अकादमिक शोधकर्ताओं, नैदानिक प्रयोगशालाओं और उद्योगों को काफी रुचि का एक क्षेत्र है।
प्रवाह cytometric विधियों द्वारा परिधीय रक्त की immunophenotyping वर्तमान में hematological दुर्दमताओं 2,3 और मानव इम्यूनो वायरस (एचआईवी) संक्रमण 4,5, प्रतिरक्षा मांगों के लिए परिधीय रक्त के विश्वसनीय immunophenotyping सत्यापन और मानकीकरण, क्योंकि उस में विशिष्ट विचार के नैदानिक प्रबंधन के लिए प्रयोग किया जाता है यद्यपि प्रतिरक्षा सेल सबसेट और सक्रियण / निरोधात्मक रिसेप्टर्स 1,6-8 पर अधिक व्यापक कवरेज की आवश्यकता है। successful immunophenotyping साधन सेटअप और सेल धुंधला प्रक्रिया 9,10 से संबंधित प्रयोग करने वाली प्रयोग परिवर्तनशीलता को कम करने के लिए सावधान मानकीकरण की आवश्यकता है। जबकि प्रवाह cytometry के लिए साधन सेटिंग्स के मानकीकरण में अच्छी तरह से पूर्व चिंता 9,11,12 संबोधित करने के लिए स्थापित किया गया है, यह स्पष्ट नहीं हुआ है कि कैसे प्रतिरक्षा सेल सबसेट और उनके सक्रियण स्थिति के कवरेज सीमित बिना सेल धुंधला से संबंधित परिवर्तनशीलता को कम करने के लिए।
एंटीजन की संख्या बढ़ जाती है पता लगाया जा करने के रूप में, तो भी त्रुटि और परिवर्तनशीलता सबऑप्टिमल अभिकर्मक वितरण और पार संदूषण के कारण के लिए अवसर है। anticoagulated पूरे रक्त की phenoptypic विश्लेषण के लिए तरीके देर नैदानिक प्रयोगशाला assays में उपयोग के लिए 1980 में स्थापित किए गए थे। ये एक ही तरीके का नमूना तैयार करने के लिए अनुसंधान प्रयोगशाला की आवश्यकताओं की सेवा। महत्वपूर्ण बात है, एंटीबॉडी नैदानिक प्रयोगशाला में प्रयोग किया जाता कॉकटेल आम तौर पर कम जटिल और एवा हैंilable पूर्व titered और निर्माता से पूर्व मिश्रित। केवल पूर्व मिश्रित एंटीबॉडी कॉकटेल का एक भी हस्तांतरण की आवश्यकता है। अनुसंधान सेटिंग में, 10-16 एंटीबॉडी के एंटीबॉडी कॉकटेल विशिष्ट हैं। प्रत्येक कॉकटेल प्रयोगशाला द्वारा स्थिरता के लिए मान्य है या प्रत्येक परख से पहले नए सिरे से तैयार किया जाना चाहिए। एक नमूना के लिए कई एंटीबॉडी कॉकटेल तैयारी 50-80 व्यक्ति एंटीबॉडी के pipetting, कि दोनों थकाऊ और त्रुटि प्रवण है एक काम करना पड़ेगा सकता है।
कॉकटेल तैयार करने के स्वचालन इस तरह के कम त्रुटियों के रूप में मैनुअल कॉकटेल तैयारी पर कई फायदे हैं, pipetting की सटीकता की वृद्धि हुई है, और संभवतः भी अभिकर्मक बर्बादी में कमी आई है। यहाँ, हम तैयारी नमूना से संबंधित परिवर्तनशीलता को कम करने के immunophenotyping की सेल-धुंधला प्रक्रिया में एक दो आयामी (2 डी) बारकोड रीडर के साथ सुसज्जित एक स्वचालित तरल हैंडलर की सफल शुरूआत की रिपोर्ट।
परिधीय रक्त की Immunophenotyping प्रतिरक्षा करने के लिए अलग-अलग प्रतिक्रियाओं में अंतर्दृष्टि पाने के लिए महत्वपूर्ण है। चुनौती प्रयोग करने वाली प्रयोग परिवर्तनशीलता 1,14 नियंत्रित करने के लिए परख मानकीकरण में निहित है। परिवर्तनशीलता का एक मुख्य स्रोत के नमूने के मानव हेरफेर में निहित है। इसलिए, यह है कि नमूना प्रसंस्करण के आंशिक या पूर्ण स्वचालन प्रयोग करने वाली प्रयोग परिवर्तनशीलता 1,14 में एक नाटकीय कमी की सुविधा होगी बोधगम्य है। इस प्रोटोकॉल में, हम हमारे सफल पूरे रक्त नमूना immunophenotyping में धुंधला के लिए 2 डी बारकोड रीडर के साथ सुसज्जित एक स्वचालित तरल हैंडलर को शुरू करने से परख परिवर्तनशीलता को कम करने के प्रयास की रिपोर्ट।
डिजाइन में, हमारे विधि बहुमुखी है और अतिरिक्त "बेस कॉकटेल" को परिभाषित करने के लिए उन्हें जोड़ने के द्वारा अन्य प्रतिरक्षा सबसेट निगरानी कर सकते हैं। इस तरह के सबसेट टी सहायक कोशिकाओं, टी नियामक कोशिकाओं बी कोशिकाओं, एन.के. कोशिकाओं, वृक्ष के समान कोशिकाओं, और monocytes (पांडुलिपि में शामिलतैयारी) 18। हम 1 अतिरिक्त मार्कर को शुरू करने से संघ की सिफारिश की एंटीबॉडी पैनलों अनुकूलित। सेल आबादी "बेस कॉकटेल" शानदार बैंगनी 421 (BV421) में कम से कम उत्सर्जन के साथ fluorochromes संयुग्मित, phycoerythrin (पीई) का उपयोग कर की पहचान की गई है, और allophycocyanin (एपीसी) डिटेक्टरों, जैसा कि हम inducible एंटीजन का पता लगाने के लिए इन चैनलों को आरक्षित करना चाहता था। यह सुविधा न केवल प्रतिरक्षा कोशिकाओं की सक्रियता स्थिति पर नजर रखने के लिए उच्चतम संवेदनशीलता सुनिश्चित करता है लेकिन यह भी नए सक्रियण मार्कर का लचीला आवास के रूप में इन तीन fluorochromes सबसे अक्सर inducible मार्कर के खिलाफ एंटीबॉडी के साथ संयुग्मित हैं सक्षम बनाता है। इसलिए, हमारे विधि न केवल पूरे रक्त immunophenotyping के लिए कॉकटेल तैयार करने के लिए उपयुक्त है, लेकिन यह भी परिधीय रक्त कोशिकाओं mononuclear और कोशिकाओं अलग-अलग ऊतकों (जैसे, ट्यूमर) से बरामद सहित अन्य नमूने धुंधला करने के लिए उपयोगी है।
सफल परिचयहमारे विधि के duction Labware तैयारी में कदम के लिए विशेष ध्यान देने की, और programing और विधि के निष्पादन की आवश्यकता है। 2 डी बारकोड ट्यूब की तैयारी मानव पठनीय लेबल और नामित ट्यूबों के लिए एंटीबॉडी के हस्तांतरण के साथ लेबलिंग भी शामिल है। त्रुटियों की शुरूआत को रोकने के लिए, हम दो लोगों के साथ यह कर सलाह देते हैं। जब भी स्प्रेडशीट बदल रहा है, जांचकर्ताओं को सत्यापित करना चाहिए विधि ठीक से काम करता है। programing के दौरान उचित pipetting तरीकों का चयन सफल तरल हस्तांतरण सुनिश्चित करता है। LLS एंटीबॉडी ट्यूब, जिसके लिए हम या तो P50 या P200 प्रवाहकीय युक्तियों का उपयोग मलबे के नीचे से उपजी हो रही बिना pipetting सक्षम बनाता है। LLS P1000 खरीदारों के लिए एक अच्छा विकल्प नहीं हो सकता है के रूप में LLS P1000 सुझावों के साथ और अधिक संवेदनशील है और कभी कभी झूठा बुलबुले की उपस्थिति से शुरू हो गया। Labware परिभाषा हाइट्स, प्रत्येक साधन के रूप में सबऑप्टिमल तरल हस्तांतरण हो सकता है के लिए समायोजित किया जाना चाहिए, उदाहरण के लिए, अगर वहाँ सुझावों की बढ़त के बीच पर्याप्त जगह नहीं हैऔर ट्यूबों के नीचे। जैसा कि चित्र में दिखाया गया है 12, अगर "बेस कॉकटेल" और / या "एक्टिवेशन कॉकटेल" अच्छी तरह से vortexed नहीं कर रहे हैं, यह सबऑप्टिमल धुंधला में परिणाम हो सकता है।
हम एक वैकल्पिक दृष्टिकोण के रूप में सेल धुंधला के लिए lyophilized अभिकर्मकों का उपयोग अभिकर्मक वितरण 19 के साथ संबंधित परिवर्तनशीलता को कम करने के बारे में सोचा। हालांकि, शानदार बैंगनी रंगों के बहुलक conjugates एक-दूसरे के कारण गैर विशिष्ट संकेतों के साथ बातचीत करने के लिए जाना जाता है। जैसे, उनका कहना है दो से अधिक बहुलक conjugates (जैसे, BV421 और BV650 आदि) lyophilized अभिकर्मकों में गैर विशिष्ट संकेतन कारण हो सकता है (जैसे, BV421 + जनसंख्या में BV650 पृष्ठभूमि संकेत की वृद्धि) 20। इसके अलावा, lyophilized अभिकर्मकों नई धुंधला सहित के लिए लचीलापन की कमी है। वे आम तौर पर अधिक महंगे हैं और एक थोक आदेश की आवश्यकता होती है। उन कारणों के लिए, हम 2 डी बारकोड ट्यूब से लैस स्वचालित तरल हैंडलर का उपयोग करने के लिए चुना है। हालांकि यह टीakes समय की स्थापना की और एक अग्रिम निवेश पर जोर देता साधन खरीद करने के लिए लंबे समय में इस तरह के कारकों में उत्पादकता वृद्धि और assays के reproducibility द्वारा लिए मुआवजा दिया जाएगा, में करने के लिए। वास्तव में, कुछ समूहों ने पहले immunophenotyping या इसी तरह के अनुप्रयोगों 21,22 के अपने कार्यप्रवाह में स्वचालित तरल हैंडलर के सफल एकीकरण की सूचना दी। प्रवाह cytometry विश्लेषण के लिए स्वचालित समाधान भी वाणिज्यिक स्रोतों (FACS स्पा तृतीय, स्वचालित कॉकटेल तैयारी कार्य केंद्र, और FlowStainer) से उपलब्ध हैं। यह आगे इंगित करता है immunophenotyping के लिए स्वचालित कॉकटेल तैयार करने के लिए एक बड़ी जरूरत है।
इस तकनीक के माहिर के बाद, हम कल्पना है कि पूरी तरह से स्वचालित पूरे रक्त immunophenotyping के विकास के लिए आगे प्रयोग करने वाली परिवर्तनशीलता प्रयोग कम हो जाएगा और पूरे रक्त immunophenotyping भी 23 की स्थापना एक multicenter चिकित्सीय परीक्षण में संभव बना सकता है। हम पहले से ही उपयोग कर एक lyse था शुरू कर दिया हैज सहायक सेल और धोने कदम स्वचालित करने के लिए। हम यह भी कल्पना है कि 2 डी बारकोड ट्यूबों में एंटीबॉडी की मात्रा और अभिकर्मक वितरण की ट्रैकिंग के स्वचालित दृढ़ संकल्प बहुत क्रमश एंटीबॉडी की सूची और हमारे विधि से अधिक गुणवत्ता नियंत्रण में सुधार होगा।
The authors have nothing to disclose.
We thank Hannah Puzas for assistance with system design and configuration, and Kevin Khovananth for technical advice. Funding for this work was provided by The Hearst Foundations and the Providence Portland Medical Foundation.
BD LSRFortessa | BD Biosciences | Flow cytometer | |
NXp Span-8 Laboratory Automation Workstation | Beckman Coulter | A31839 | Laboratory Automation Workstation |
Insert, Tube, 11 mm, White, for 1.5 mL Microfuge Tubes (case of 25) | Beckman Coulter | 373696 | Accessary for 24-Position Tube Rack to accommodate microfuge tubes. |
LLS kit | Beckman Coulter | 719262 | Attach bottom of the deck in Laboratory Automation Workstation to enable liquid level sensing |
24-Position Tube Rack | Beckman Coulter | 373661 | Tube rack to hold microfuge tubes for antibody cocktails or blood |
BIOHAZARD AUTOCLAVE BAGS 12×24 IN. RED | LabMart | M111416 | Disposable autoclave bags for the Laboratory Automation Workstation |
VisionMate High Speed 2D Barcode Reader | Thermo Scientific | AB-1850 | 2D barcode reader |
8-Channel Handheld Screw Cap Capper/Decapper | Thermo Scientific | 4105MAT | For de-capping and capping 2D barcode tubes |
Microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | 02-681-335 | For making cocktail in or supplying blood speciment to the Laboratory Automation Workstation |
CoolRack XT CFT24 | biocision | BCS-534 | To hold sample tubes. |
1.0 mL Matrix ScrewTop Amber Tubes in Latch Racks | Thermo Scientific | 3741AMB | 2D barcode tubes to store fluorescent dye-cojugated antibodies |
Biomek Span-8 P1000 Tips, Conductive, Pre-sterile with Barrier, 1025 µL | Beckman Coulter | 987925 | Tips for Laboratory Automation Workstation |
Biomek Span-8 P50 Tips, Conductive, Pre-sterile with Barrier, 50 µL (Case of 10 racks) | Beckman Coulter | B01091 | Tips for Laboratory Automation Workstation |
Biomek Span-8 P250 Tips, Conductive, Pre-sterile with Barrier (Case of 10 racks) | Beckman Coulter | 394627 | Tips for Laboratory Automation Workstation |
BD FACS Lysing Solution 10X Concentrate | BD Biosciences | 349202 | RBC lysis |
Falcon Round-Bottom Polystyrene Tubes | Fisher Scientific | 14-959-5 | Sample tubes |
Anti-CD45 FITC | BD Biosciences | 347463 | Effector T cell panel (base) |
Anti-CD3 Alexa Fluor 700 | eBioscience | 56-0038-42 | Effector T cell panel (base) |
Anti-CD4 PerCPCy5.5 | BD Biosciences | 341654 | Effector T cell panel (base) |
Anti-TCRgd BV650 | BD Biosciences | 564156 | Effector T cell panel (base) |
Anti-TCRab BV786 | BD Biosciences | 563825 | Effector T cell panel (base) |
Anti-CD8 APC-H7 | BD Biosciences | 560179 | Effector T cell panel (base) |
Anti-CCR7 PE-CF594 | BD Biosciences | 562381 | Effector T cell panel (base) |
Anti-CD45RA PE-Cy7 | BD Biosciences | 337167 | Effector T cell panel (base) |
Anti-HLA-DR BV421 | BD Biosciences | 562804 | Effector T cell panel (activation) |
Anti-CD278(ICOS) PE | BD Biosciences | 557802 | Effector T cell panel (activation) |
Anti-CD38 APC | BD Biosciences | 340439 | Effector T cell panel (activation) |
Anti-CD279(PD1) BV421 | BD Biosciences | 562516 | Effector T cell panel (activation) |
Anti-CD357(GITR) PE | eBioscience | 12-5875-42 | Effector T cell panel (activation) |
Anti-CD137(41BB) APC | BD Biosciences | 550890 | Effector T cell panel (activation) |
Anti-CD69 BV421 | BD Biosciences | 562884 | Effector T cell panel (activation) |
Anti-CD314(NKG2D) PE | BD Biosciences | 557940 | Effector T cell panel (activation) |
Anti-CD134(OX40) APC | BioLegend | 350008 | Effector T cell panel (activation) |
BD Vacutainer Plastic Blood Collection Tubes with Sodium Heparin: Conventional Stopper | Fisher Scientific | 02-689-6 | For collecting blood |
Albumin, Bovine Serum, Fraction V, RIA and ELISA Grade | EMD Millipore | 126593 | For flow wash buffer |
Sodium Azide | Sigma-Aldrich | S8032 | For flow wash buffer |
Heparin, sodium salt | Affimetrix | 16920 | For flow wash buffer |
Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS), 1X, with Calcium, Magnesium, without Phenol Red | GE Healthcare Life Sciences | SH30588.02 | For flow wash buffer |