सृजन CRISPR / Cas9 मध्यस्थता Monoallelic विलोपन माउस भ्रूणीय स्टेम कोशिकाओं में बढ़ाने समारोह का अध्ययन करने
Summary
Experimental validation of enhancer activity is best approached by loss-of-function analysis. Presented here is an efficient protocol that uses CRISPR/Cas9 mediated deletion to study allele-specific regulation of gene transcription in F1 ES cells which contain a hybrid genome (Mus musculus129 x Mus castaneus).
Abstract
Enhancers control cell identity by regulating tissue-specific gene expression in a position and orientation independent manner. These enhancers are often located distally from the regulated gene in intergenic regions or even within the body of another gene. The position independent nature of enhancer activity makes it difficult to match enhancers with the genes they regulate. Deletion of an enhancer region provides direct evidence for enhancer activity and is the gold standard to reveal an enhancer’s role in endogenous gene transcription. Conventional homologous recombination based deletion methods have been surpassed by recent advances in genome editing technology which enable rapid and precisely located changes to the genomes of numerous model organisms. CRISPR/Cas9 mediated genome editing can be used to manipulate the genome in many cell types and organisms rapidly and cost effectively, due to the ease with which Cas9 can be targeted to the genome by a guide RNA from a bespoke expression plasmid. Homozygous deletion of essential gene regulatory elements might lead to lethality or alter cellular phenotype whereas monoallelic deletion of transcriptional enhancers allows for the study of cis-regulation of gene expression without this confounding issue. Presented here is a protocol for CRISPR/Cas9 mediated deletion in F1 mouse embryonic stem (ES) cells (Mus musculus129 x Mus castaneus). Monoallelic deletion, screening and expression analysis is facilitated by single nucleotide polymorphisms (SNP) between the two alleles which occur on average every 125 bp in these cells.
Introduction
विनियामक तत्वों न्यायपालिका जीन अभिव्यक्ति 2 के कारण इन तत्वों के विकास के 1 और संशोधन के दौरान जीन अभिव्यक्ति के स्थानिक-सामयिक ठीक ट्यूनिंग रोग में परिणाम कर सकते हैं के लिए महत्वपूर्ण हैं। कई रोग से जुड़े जीनोम चौड़ा संघ अध्ययन द्वारा की पहचान क्षेत्रों के गैर-कोडिंग क्षेत्रों में हैं और ट्रांसक्रिप्शनल enhancers 3-4 की विशेषताएं हैं। Enhancers पहचान करने और उन्हें जीन वे विनियमित जटिल है क्योंकि वे अक्सर जीन वे विनियमित से कई kilobases दूर स्थित हैं और एक ऊतक विशेष ढंग से 5-6 में सक्रिय किया जा सकता है के साथ मिलान। बढ़ाने भविष्यवाणियों सामान्यतः हिस्टोन संशोधन के निशान, मध्यस्थ-cohesin परिसरों पर आधारित हैं और सेल प्रकार विशिष्ट प्रतिलेखन के बंधन 7-10 कारकों। भविष्यवाणी की enhancers के मान्यकरण सबसे अधिक बार एक वेक्टर आधारित परख जिसमें बढ़ाने एक पत्रकार जीन 11-12 की अभिव्यक्ति को सक्रिय करता है के माध्यम से किया जाता है। इन आंकड़ों वी प्रदानख्यात बढ़ाने दृश्यों की नियामक क्षमता के बारे में जानकारी aluable लेकिन उनके अंतर्जात जीनोमिक संदर्भ में उनके कार्य को प्रकट या जीन वे विनियमित की पहचान नहीं है। जीनोम संपादन से नुकसान के समारोह विश्लेषण उनकी अंतर्जात संदर्भ में विनियामक तत्वों के समारोह का अध्ययन करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण के रूप में कार्य करता है।
जीनोम संपादन, अर्थात् CRISPR / Cas9 जीनोम संपादन प्रणाली में हाल के अग्रिमों, जीनोम समारोह की जांच की सुविधा। CRISPR / Cas9 प्रणाली कई जैविक प्रणालियों के लिए प्रयोग करने में आसान और अनुकूलनीय है। Cas9 प्रोटीन एक गाइड आरएनए (gRNA) 13 से जीनोम में एक विशिष्ट साइट के लिए लक्षित है। SpCas9 / gRNA जटिल अपने लक्ष्य जीनोमिक अनुक्रम के लिए जीनोम जो एक protospacer आसन्न मूल भाव (पीएएम) अनुक्रम, NGG 14-15 के लिए 5 होना चाहिए 'स्कैन करता है। gRNA अपने लक्ष्य के लिए, एक 20 न्यूक्लियोटाइड (एनटी) अनुक्रम gRNA के पूरक के बेस बाँधना, को सक्रिय करता है SpCas9 nuclease गतिविधि एक doubl में जिसके परिणामस्वरूपई कतरा तोड़ (डीएसबी) 3 बीपी पीएएम अनुक्रम की नदी के ऊपर। विशिष्टता gRNA बीज क्षेत्र में पूरा आधार बाँधना के माध्यम से हासिल की है, 6-12 पीएएम से सटे nt; इसके विपरीत, बेमेल 5 'बीज की आमतौर पर 16-17 बर्दाश्त कर रहे हैं। या तो गैर मुताबिक़ अंत में शामिल होने से (NHEJ) डीएनए की मरम्मत या अनुरूपता निर्देशित मरम्मत (एचडीआर) mechanisms.NHEJ डीएनए की मरम्मत अक्सर बनाता लक्ष्य साइट पर कुछ बीपी कि बाधित कर सकते हैं के सम्मिलन / विलोपन (indels) शुरू की डीएसबी ठीक हो सकता है एक जीन का खुला पढ़ने फ्रेम (ओआरएफ)। जीनोम दो gRNAs है, जो ब्याज के क्षेत्र दिशा में बड़ा विलोपन उत्पन्न करने के लिए, 18-19 इस्तेमाल किया जा सकता है। यह दृष्टिकोण ठिकाना नियंत्रण क्षेत्रों या सुपर-वर्धक जो पारंपरिक enhancers 9,18,20-22 से बड़े होते हैं में क्लस्टर ट्रांसक्रिप्शनल enhancers के अध्ययन के लिए विशेष रूप से उपयोगी है।
Monoallelic विलोपन प्रतिलेखन के सीआईएस -regulation के अध्ययन के लिए एक मूल्यवान मॉडल हैं। चांग मनायाप्रतिलेख स्तर में ई एक बढ़ाने की monoallelic हटाए जाने के बाद confounding प्रभाव है कि हो सकता है जब दोनों alleles के प्रतिलेखन संभावित सेलुलर फिटनेस को प्रभावित प्रभावित है बिना जीन विनियमन में उस बढ़ाने की भूमिका के लिए संबद्ध। कम अभिव्यक्ति का मूल्यांकन हालांकि भेद करने के लिए जंगली प्रकार एलील से हटा क्षमता के बिना मुश्किल है। इसके अलावा, दो alleles भेद करने की क्षमता के बिना प्रत्येक एलील पर विलोपन जीनोटाइपिंग चुनौतीपूर्ण है, विशेष रूप से 1 एमबी 23 जिसमें यह पीसीआर द्वारा पूरे जंगली प्रकार क्षेत्र बढ़ाना मुश्किल है करने के लिए> 10 केबी की बड़ी विलोपन के लिए है। मुसलमानों castaneus साथ क्रासिंग मस मस्कुलस 129 द्वारा उत्पन्न F1 ES कोशिकाओं के उपयोग के दो alleles एलील विशिष्ट पीसीआर 18,24 द्वारा भेदभाव किया जा करने के लिए अनुमति देता है। इन कोशिकाओं में संकर जीनोम एलील विशिष्ट विलोपन स्क्रीनिंग और अभिव्यक्ति विश्लेषण की सुविधा। औसत पर वहाँ एक एसएनपी इन दो जीनोम के बीच हर 125 बीपी हैअभिव्यक्ति और जीनोटाइपिंग के लिए प्राइमर डिजाइन में लचीलापन प्रदान विश्लेषण करती है। एक एसएनपी की उपस्थिति प्राइमर पिघलने के तापमान (टी एम) को प्रभावित करने और दो alleles 25 के भेदभाव की अनुमति के लिए वास्तविक समय मात्रात्मक पीसीआर (qPCR) प्रवर्धन में विशिष्टता लक्षित कर सकते हैं। इसके अलावा प्राइमर के 3 'अंत के भीतर एक बेमेल बहुत प्राइमर अवांछित एलील लक्ष्य 26 के प्रवर्धन रोकने से विस्तार करने के लिए डीएनए पोलीमरेज़ की क्षमता को प्रभावित करती है। निम्नलिखित प्रोटोकॉल में वर्णित एक से अधिक 1 केबी का एलील विशिष्ट बढ़ाने विलोपन और बाद में अभिव्यक्ति विश्लेषण CRISPR / Cas9 जीनोम संपादन प्रणाली (चित्रा 1) का उपयोग के लिए F1 ES कोशिकाओं का इस्तेमाल होता है।
चित्रा 1. बढ़ाने विलोपन सीआईएस -reg अध्ययन करने के लिए CRISPR / Cas9 का उपयोग करजीन अभिव्यक्ति की आबादी। (ए) मस मस्कुलस 129 और मुसलमानों के बीच एक क्रॉस castaneus द्वारा उत्पन्न F1 ES कोशिकाओं एलील विशिष्ट हटाने के लिए अनुमति देने के लिए उपयोग किया जाता है। (बी) के दो गाइड आरएनए (gRNA) बढ़ाने क्षेत्र की एक बड़ी Cas9 की मध्यस्थता विलोपन प्रेरित करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं। (सी) प्राइमर सेट बड़ी मोनो और द्वि allelic विलोपन की पहचान करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं। नारंगी प्राइमरों अंदर प्राइमरों हैं, बैंगनी प्राइमरों gRNA flanking प्राइमरों कर रहे हैं बाहर प्राइमरों और हरे रंग प्राइमरों हैं। (डी) जीन अभिव्यक्ति में परिवर्तन एलील विशिष्ट qPCR का उपयोग कर निगरानी कर रहे हैं। RFU अर्थ रिश्तेदार प्रतिदीप्ति इकाइयों। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
Protocol
Representative Results
Discussion
CRISPR / Cas9 मध्यस्थता जीनोम संपादन प्रौद्योगिकी जीनोम संशोधन के लिए एक सरल, तेज और सस्ता तरीका प्रदान करता है। विधि यहाँ विस्तृत पैदा करते हैं और कार्यात्मक बढ़ाने लक्षण वर्णन के लिए monoallelic बढ़ाने विलोपन का व…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We would like to thank all the members of the Mitchell lab for helpful discussions. This work was supported by the Canadian Institutes of Health Research, the Canada Foundation for Innovation and the Ontario Ministry of Research and Innovation (operating and infrastructure grants held by JAM).
Materials
| Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | NEB | M0530S | high fidelity DNA polymerase used in gRNA assembly |
| Gibson Assembly Master Mix | NEB | E2611L | |
| gRNA_Cloning Vector | Addgene | 41824 | A target sequence is cloned into this vector to create the gRNA plasmid |
| pCas9_GFP | Addgene | 44719 | Codon-optimized SpCas9 and EGFP co-expression plasmid |
| AflII | NEB | R0520S | |
| EcoRI | NEB | R3101S | |
| Neon Transfection System 100 µL Kit | Life Technologies | MPK10096 | Microporator transfection technology |
| prepGEM | ZyGEM | PT10500 | genomic DNA extraction reagent |
| Nucleo Spin Gel & PCR Clean-up | Macherey-Nagel | 740609.5 | |
| High-Speed Plasmid Mini Kit | Geneaid | PD300 | |
| Maxi Plasmid Kit Endotoxin Free | Geneaid | PME25 | |
| SYBR select mix for CFX | Life Technologies | 4472942 | qPCR reagent |
| iScript cDNA synthesis kit | Bio-rad | 170-8891 | Reverse transcription reagent |
| 0.25% Trypsin with EDTA | Life Technologies | 25200072 | |
| PBS without Ca/Mg2+ | Sigma | D8537 | |
| 0.5M EDTA | Bioshop | EDT111.500 | |
| HBSS | Life Technologies | 14175095 | |
| 1M HEPES | Life Technologies | 13630080 | |
| BSA fraction V (7.5%) | Life Technologies | 15260037 | |
| Max Efficiency DH5α competent cells | Invitrogen | 18258012 | |
| FBS | ES cell qualified | FBS is subjected to a prior testing in mouse ES cells for pluripotency | |
| DMSO | Sigma | D2650 | |
| Glutamax | Invitrogen | 35050 | |
| DMEM | Life Technologies | 11960069 | |
| Pencillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140 | |
| Sodium pyruvate | Invitrogen | 11360 | |
| Non-essential aminoacid | Invitrogen | 11140 | |
| β-mercaptoethanol | Sigma | M7522 | |
| 96-well plate | Sarstedt | 83.3924 | |
| Sealing tape | Sarstedt | 95.1994 | |
| CoolCell LX | Biocision | BCS-405 | alcohol-free cell freezing container |
| CHIR99021 | Biovision | 1748-5 | Inhibitor for F1 ES cell culture |
| PD0325901 | Invivogen | inh-pd32 | Inhibitor for F1 ES cell culture |
| LIF | Chemicon | ESG1107 | Inhibitor for F1 ES cell culture |
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