Summary

תרבויות יצירה ראשיות פיברובלסטים מרקמות אוזן וזנב עכבר

Published: January 10, 2016
doi:

Summary

אנו מתארים הליך ניסוי פשוט ומהיר ליצירת fibroblasts העיקרי מהאוזניים והזנבות של עכברים. ההליך אינו דורש הכשרה מיוחדת ובעלי חיים יכול לשמש לדור של תרבויות פיברובלסטים מאוזניים מאוחסנות על RT עד 10 ימים.

Abstract

תאים ראשוניים נגזרים ישירות מהרקמה ונחשבים לנציג נוסף של המצב הפיזיולוגי של תאים בגוף חי משורות תאים הוקמו. עם זאת, יש לי תרביות תאים ראשוניות בדרך כלל אורך חיים סופי וצריכה להיות הוקמו מחדש בתדירות גבוהה. פיברובלסטים הם מקור נגיש של תאים ראשוניים. כאן, אנו דנים בהליך ניסיוני פשוט ומהיר להקמת תרבויות פיברובלסטים עיקריות מאוזניים וזנבות של עכברים. הפרוטוקול ניתן להשתמש כדי להקים תרבויות עיקריות פיברובלסטים מאוזניים מאוחסנות על RT עד 10 ימים. כאשר הפרוטוקול ואחריו בזהירות, זיהומים צפויים להתרחש למרות השימוש ברקמות שאינן סטרילי מאוחסנות לזמן ממושך ובמקרים מסוימים. Fibroblasts להתרבות במהירות בתרבות ובניתן להרחיב למספרים משמעותיים לפני שעברנו הזדקנות replicative.

Introduction

תאים ראשוניים נגזרים מרקמת חיה ותרבותית בתנאים במבחנה. מקובל להניח כי תאים ראשוניים דומים למצב הפיזיולוגי ורקע גנטי של הרקמה שממנו הם מקורו משורות תאים הונצחו או גידול 1 באופן הדוק יותר. מסיבה זו, תאים ראשוניים מייצגים מודל שימושי לחקר 2,3 שאלות ביולוגי. עם זאת, בניגוד לשורות תאים קבעו כי לגדול ללא הגבלת זמן, תאים ראשוניים סופו של דבר לעבור הזדקנות בתרבות ובצריכים להיות הוקמו מחדש בתדירות גבוהה.

תאים ראשוניים נפוצים כוללים fibroblasts, תאי אפיתל, תאי אנדותל, תאי T, תאי B, מקרופאגים נגזר מח עצם (BMDM) ותאים דנדריטים נגזר מח עצם (BMDC). Fibroblasts לעתים קרובות מנוצלים כמודל תרבית תאים ראשוניים. הם מציעים יתרונות מרכזיים על פני תאים ראשוניים אחרים. תרביות תאים בקלות הוקמו, מתוחזק בקלות ולא דורשות purification של תאים לפני התרבות. יש להם תפוצה ראשונית מהירה ואין דרישה לפרוטוקולים בינוניים או הפעלה מיוחדות. Fibroblasts ניתן transfected ביעילות באמצעות ביולוגי, כימי, ופרוטוקולים פיזיים 4,5. יש אפשרות לאחסן את האוזניים של עד 10 ימים בRT לפני הקמת תרביות תאים. תרבויות פיברובלסטים הם תורמים להדמיה של תהליכי cytoplasmic ומתאימים לתכנות מחדש לתאי גזע pluripotent המושרה (iPS) 6.

פיברובלסטים הם תאים חשובים של רקמת החיבור שמפרישים חלבוני קולגן ומטריקס 7. הם מספקים את המסגרת המבנית ברקמות רבות 8 ולשחק תפקיד חיוני בריפוי פצעים ו9,10 תיקון רקמות.

כאן, אנו מתארים פרוטוקול פשוט ומהיר (<4 שעות) להקים תרבויות פיברובלסטים מאוזניים וזנבות של עכברים 11. הפרוטוקול מחייב עכבר מינימאליניסיון לקצור את הרקמות (בניגוד לפרוטוקולים אחרים 12,13) ​​וניתן להשתמש בם כדי להקים תרבויות מאוזניים מאוחסנות במדיום ב RT לעד 10 ימים.

Protocol

עכברים שוכנו בתנאי הפתוגן ללא בעמידה בהנחיות המוסדית עד מתת חסד (המוסדי הטיפול בבעלי חיים והנחיות ועדת שימוש (IACUC) באוניברסיטה הלאומית של סינגפור והוועדה הלאומית המייעצת למחקר בבעלי חיים מעבדה (NACLAR) הנחיות). 1. עכברים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"…

Representative Results

הפקה של fibroblasts מתוצאות רקמה בכמות משמעותית של רקמת פסולת (איור 1). בניגוד לפסולת רקמות, fibroblasts לדבוק משטחי פלסטיק בתרבית רקמה בין יום 1 ו -3 של התרבות. הבינוני של תרבויות פיברובלסטים ניתן לשנות בבטחה ביום 3 של תרבות, שאמור להקטין באופן משמעותי את הרמות של הווה פסו…

Discussion

כאן אנו מספקים הליך ניסוי פשוט, זול ומהיר להקמת תרבויות פיברובלסטים עיקריות מאוזניים וזנבות של עכברים. החילוץ צריך לגרום fibroblasts החלוקה חסיד ומהירות תוך 3 ימים לאחר בידוד של הרקמה. מגבלה חשובה של תאים ראשוניים היא הזדקנות, מעצר צמיחה קבוע 15. שימוש בפרוטוקול, ניתן …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This work was supported by the NRF grant HUJ-CREATE – Cellular and Molecular Mechanisms of Inflammation.

Materials

RPMI-1640 HyClone SH30027.01
Fetal Calf Serum HyClone SV30160.03
2-mercaptoethanol Sigma-Aldrich M3148
Asparagine Sigma-Aldrich A4159
Glutamine Sigma-Aldrich G8540
Penicillin/Streptomycin HyClone SV30010
Ethanol Merck Millipore 107017 Absolute for analysis
Collagenase D Roche Diagnostics 11088866001 From Clostridium histolyticum, lyophilized, non-sterile
Pronase protease Merck Millipore 53702 From Streptomyces griseus 
Tris buffer (pH 8) 1st BASE 1415 Ultra pure grade
0.5M EDTA (pH 8) 1st BASE BUF-1053 Biotechnology grade
10X Phosphate Buffered Saline (PBS) 1st BASE BUF-2040-10X4L Ultra pure grade
Trypsin-EDTA solution 10X Sigma-Aldrich 59418C-100ML 0.5% trypsin, 0.2% EDTA, trypsin gamma irradiated by SER-TAIN process, without phenol red, in saline
Amphotericin B Sigma-Aldrich A2492-20ml 250 μg/ml in deionized water, sterile-filtered
Scissors Aesculap
Forcep Aesculap AE-BD312R
0.2 μM syringe filter Sartorius Stedim 16534
70 μM cell strainer SPL 93070
Syringe plunger Terumo SS+10L
Cryovial tube NUNC 368362
1.7 ml microcentrifuge tube Axygen MCT-175-C
10 cm cell culture dish Greiner 664160 Cell culture treated dish 
15 ml conical bottom tube Greiner 188271
50 ml conical bottom tube Greiner 227261
Water bath GFL 1002
Centrifuge Eppendorf 5810R
Incubation shaker Sartorius Stedim Certomat-BS1
Zeiss Axiovert 25 light microscope Carl Zeiss AG

References

  1. Fitzpatrick, L. E., McDevitt, T. C. Cell-derived matrices for tissue engineering and regenerative medicine applications. Biomater Sci. 3 (1), 12-24 (2015).
  2. Elenbaas, B., et al. Human breast cancer cells generated by oncogenic transformation of primary epithelial cells. Genes Dev. 15 (1), 50-65 (2001).
  3. Stansley, B., Post, J., Hensley, K. A comparative review of cell culture systems for the study of microglial biology in Alzheimer’s disease. J Neuroinflammation. 9 (1), 115 (2012).
  4. Lim, J., Dobson, J. Improved transfection of HUVEC and MEF cells using DNA complexes with magnetic nanoparticles in an oscillating field. J Genet. 91 (2), 223-227 (2012).
  5. Li, M., et al. High-efficiency transduction of fibroblasts and mesenchymal stem cells by tyrosine-mutant AAV2 vectors for their potential use in cellular therapy. Hum Gene Ther. 21 (11), 1527-1543 (2010).
  6. Patel, M., Yang, S. Advances in reprogramming somatic cells to induced pluripotent stem cells. Stem Cell Rev. 6 (3), 367-380 (2010).
  7. Newman, A. C., Nakatsu, M. N., Chou, W., Gershon, P. D., Hughes, C. C. The requirement for fibroblasts in angiogenesis: fibroblast-derived matrix proteins are essential for endothelial cell luman formation. Mol Biol Cell. 22 (20), 3791-3800 (2011).
  8. Ohlund, D., Elyada, E., Tuveson, D. Fibroblast heterogeneity in the cancer wound. J Exp Med. 211 (8), 1503-1523 (2014).
  9. Guo, S., Dipietro, L. A. Factors affecting wound healing. J Dent Res. 89 (3), 219-229 (2010).
  10. Werner, S., Krieg, T., Smola, H. Keratinocyte-fibroblast interactions in wound healing. J Invest Dermatol. 127 (5), 998-1008 (2007).
  11. Shen, Y. J., et al. Genome-derived cytosolic DNA mediates type I interferon-dependent rejection of B cell lymphoma cells. Cell Rep. 11 (3), 460-473 (2015).
  12. Seluanov, A., Vaidya, A., Gorbunova, A. Establishing primary adult fibroblast cultures from rodents. J Vis Exp. (44), (2010).
  13. Baglole, C. J., et al. Isolation and phenotypic characterization of lung fibroblasts. Methods Mol Med. 117, 115-127 (2005).
  14. Alt, E., et al. Fibroblasts share mesenchymal phenotypes with stem cells, but lack their differentiation and colony-forming potential. Biol Cell. 103 (4), 197-208 (2011).
  15. Kuilman, T., Michaloglou, C., Mooi, W. J., Peeper, D. S. The essence of senescence. Genes Dev. 24 (22), 2463-2479 (2010).
  16. Lander, M. R., Moll, B., Rowe, W. P. A procedure for culture of cells from mouse tail biopsies: brief communication. J Natl Cancer Inst. 60 (2), 477-478 (1978).
  17. Moore, C. B., Allen, I. C. Primary ear fibroblast derivation from mice. Methods Mol Biol. (1031), 65-70 (2013).
  18. Liu, J., et al. Generation of stable pluripotent stem cells from NOD mouse tail-tip fibroblasts. Diabetes. 60 (5), 1393-1398 (2011).

Play Video

Cite This Article
Khan, M., Gasser, S. Generating Primary Fibroblast Cultures from Mouse Ear and Tail Tissues. J. Vis. Exp. (107), e53565, doi:10.3791/53565 (2016).

View Video