This protocol describes how to generate a Drosophila S2 cell line that is sensitive to small molecule inhibitors of kinesin-5. The use of these cells in a cell-based error correction assay is also outlined.
Kinetochores are large protein-based structures that assemble on centromeres during cell division and link chromosomes to spindle microtubules. Proper distribution of the genetic material requires that sister kinetochores on every chromosome become bioriented by attaching to microtubules from opposite spindle poles before progressing into anaphase. However, erroneous, non-bioriented attachment states are common and cellular pathways exist to both detect and correct such attachments during cell division. The process by which improper kinetochore-microtubule interactions are destabilized is referred to as error correction. To study error correction in living cells, incorrect attachments are purposely generated via chemical inhibition of kinesin-5 motor, which leads to monopolar spindle assembly, and the transition from mal-orientation to biorientation is observed following drug washout. The large number of chromosomes in many model tissue culture cell types poses a challenge in observing individual error correction events. Drosophila S2 cells are better subjects for such studies as they possess as few as 4 pairs of chromosomes. However, small molecule kinesin-5 inhibitors are ineffective against Drosophila kinesin-5 (Klp61F). Here we describe how to build a Drosophila cell line that effectively replaces Klp61F with human kinesin-5, which renders the cells sensitive to pharmacological inhibition of the motor and suitable for use in the cell-based error correction assay.
Equal Segregation des Genoms während der Zellteilung erfordert korrekte Wechselwirkungen zwischen den DNA repliziert und Spindel Mikrotubuli. Mikrotubuli physisch Chromosomen zu interagieren durch ein Ensemble von Proteinen, die an Zentromeren als Kinetochor 1 bekannt versammelt. Korrekte Verteilung der Chromosomen erfordert Schwester Kinetochore sind biorientierte, wobei jede Schwester mit Mikrotubuli von gegenüberliegenden Spindelpole Ursprung verbunden. Kinetochor Mikrotubuli (kt-MT) Anlagen, die in der biorientierten Konformation nicht schnell und effizient destabilisiert, die Gelegenheit zu Biorientierung in einem Prozess als Fehlerkorrektur bekannt zu etablieren ist. Eine Fehlerkorrektur-Assay, die zuvor in Säugetierzellen hergestellt wurde 5 erfordert die Montage monopolare Spindeln mit umkehrbarer niedermolekularen Inhibitoren gegen Eg5 (Kinesin-5). Die medikamentöse Behandlung erzeugt eine Vielzahl von fehlerhaften syntelic Anhänge, in denen Both Schwester Kinetochoren zu befestigen, um die gleiche Spindel-Pol. Eine nachfolgende Auswaschung des Wirkstoffs ermöglicht die Visualisierung der dem Fehlerkorrekturverfahren. Die Fehlerkorrektur-Assay kann in Anwesenheit von Kleinmolekül-Inhibitoren oder Niederschlägen durchgeführt, um den Beitrag von Kandidatenproteinen auf die Korrektur fehlerhafter kt-MT-Anhänge zu untersuchen.
Die Fähigkeit zur Fehlerkorrektur in lebenden Zellen sichtbar zu machen ist ein leistungsfähiges Werkzeug, um die molekularen Mechanismen in diesem komplexen Prozess beteiligten weiter zu verstehen. Die große Anzahl von in den meisten Zelllinien vorhanden Chromosomen stellt jedoch eine Herausforderung bei der Beobachtung einzelner kt-MT-Anhänge. Drosophila S2 Zellen wäre ideal für die Anwendung des Fehlerkorrektur Assay, da sie so wenig wie 4 Chromosomen 6, aber kleine Molekülinhibitoren enthalten von Kinesin-5, wie etwa S-Trityl-L-cystein (STLC) und Monastrol 7-9 nicht beeinträchtigen Spindelanordnung oder Kinesin-5 Motorik in Drosophila-Zellen. Deshalb Gattungented ein Drosophila S2-Zelllinie menschlichen Kinesin-5 unter einem induzierbaren Promotor, die empfindlich auf Kinesin-5-Hemmer ist, zum Ausdruck bringen. Dieses Protokoll beschreibt, wie die endogenen Drosophila Kinesin-5-Homologen, Klp61F Knockdown, und verwenden Sie diese Zelllinie in der zellbasierten Assay-Fehlerkorrektur.
Visualisierung von Fehlerkorrektur ist eine wertvolle Technik, um die Schritte in diesem wichtigen und komplexen zellulären Prozess beteiligt zu studieren. Um dies zu tun, werden fehlerhafte Anhänge mit reversible Inhibitoren erzeugt und die Fehlerkorrektur nach Auswaschen des Arzneimittels beobachtet. Dieser Test wurde ursprünglich unter Verwendung von Säugetier-Gewebekulturzellen 5 entwickelt. Jedoch ist die Anwesenheit einer großen Anzahl von Haftstellen in vielen Modellsäugetierzelltypen stellt eine Herausforderung bei der Beobachtung einzelner Fehlerkorrekturereignisse. Drosophila S2 Zellen besitzen so wenige wie 4 Paare von Haftstellen, so dass sie eine mehr bevorzugte Zelllinie zur Beobachtung der Fehlerkorrektur. Jedoch ist ein großer Nachteil, dass viele Inhibitoren unwirksam Drosophila S2 Zellen. Somit stellt die Fähigkeit, eine humanisierte Drosophila S2 Zelllinie zu generieren, die menschliche Kinesin-5 ein wertvolles Werkzeug, um eine Fehlerkorrektur zu studieren.
Obwohl Drosophila S2 Zellen sein kannbessere Zelllinie, um eine Fehlerkorrektur zu studieren, die mehrere Schritte bei der Erlangung der Zelllinie und umzuwerfen essentielle Gene beteiligt wirft einige Herausforderungen dieser Technik. Zum Beispiel, kann die Transfektionseffizienz ziemlich niedrig sein. Bei weniger als 20% der Zellen exprimieren die Eg5-mCherry sollte die Transfektion wiederholt werden, wie der Auswahlvorgang dauert länger. Auch kann der Anteil der Zellen, die sowohl fluoreszierende Proteine mit der Zeit ab. Dies kann durch die Spaltung von Zellen in Gegenwart von Blasticidin S HCl und Hygromycin B, um Zellen, die Eg5-mCherry und GFP-α-Tubulin jeweils auszuwählen, überwunden werden. Es ist auch wichtig zu beachten, dass Drosophila S2 Zellen Orthologe viele humane Proteine und; daher ist es wichtig, die Zuschlagsbedingungen für die endogenen Proteine zu optimieren. Zuschlags optimalen Bedingungen können in der Menge von dsRNA und die Behandlungsdauer variieren. Angesichts der Entstehung und rasche Verbesserung CRISPR-Cas9 Technologies 15-17, Erzeugung eines Drosophila-Zelllinie mit der Klp61F Gens durch menschliche Eg5 ersetzt präsentiert eine leistungsfähige Alternative, die die Grenzen der Transfektion und Zuschlags Ansatz zu überwinden wäre. Unsere Arbeit zeigt, dass Fly-zu-Mensch-Gen-Ersatz sollte ein gangbarer Weg ist in diesem Fall, obwohl die notwendigen Reagenzien, um so in Drosophila S2-Zellen tun, werden derzeit entwickelt.
Dieses Verfahren ist nicht auf Eg5 beschränkt, sondern kann angewendet, um die Funktion anderer Proteine von Interesse zu untersuchen. Bei der Verwendung von Inhibitoren, die zuvor festgelegt wurden unwirksam in Drosophila S2-Zellen zu sein, kann dieses Protokoll geändert werden, um die unmittelbare Wirkung von Inhibitoren in lebenden Zellen, ohne Bedenken bezüglich vorbei Effekte zu studieren. Die Verwendung dieses Protokolls produziert Zelllinie könnte auch im Hochdurchsatz-Screening verwendet werden analysiert, um potenzielle Medikamente gegen Proteine, die in Fehlerkorrektur beteiligt sind.
The authors have nothing to disclose.
Wir möchten Patricia Wadsworth für das Geschenk des Kinesin-5-Konstrukt danken. Diese Arbeit wurde von einer NIH Zuschusses (5 R01 GM107026) nach TJM und Research Grant No. 5-FY13-205 vom March of Dimes Foundation nach TJM, sowie die Unterstützung von der Charles H. Hood Foundation, Inc. unterstützt, Boston, MA. nach TJM
Effectine Transfection Reagent | Qiagen | 301425 | |
Klp61F cDNA | Drosophila Genomic Resource Center | 13690 | Gene Name LD15641 |
Schneider’s Media | Invitrogen | 21720-024 | |
Fetal Bovine Serum, certified | Invitrogen | 10082-147 | Heat Inactivated, US origin |
Copper (II) Sulfate (CuSO4) | Sigma | C8027-500G | 500mM stock |
S-trityl-l-cysteine | Sigma | 164739-5G | 1mM stock in DMSO |
Blasticidin HCl | Invitrogen | R21001 | 5mg/ml stock in 1x PBS |
Hygromycin B | Invitrogen | 10687010 | |
T7 Large scale RNA Production System | Promega | P1320 | The approximate dsRNA concentration from each reaction is about 5-15µg/µl |
Klp61F RNAi F primer | Invitrogen | TAATACGACTCACTATAGGGTA-TTTGCGCATTATTTTAAAA | |
Klp61F RNAi R primer | Invitrogen | TAATACGACTCACTATAGGGAT-ATTGATCAATTGAAAC | |
PCR clean-up kit | Mo Bio Laboratories, Inc | 1250 | |
Concanavalin A | Sigma | C5275 | 0.5mg/ml solution made by dissolving in 1xPBS. |
Boiled Donkey Serum | Jackson ImmunoResearch Labs | 017-000-121 | 5% stock solution in 1X PHEM buffer, bring solution up to boil. Stored in 4°C. |
Mounting Media | 20mM Tris pH 8.0, 0.5% N-propyl gallate, 90% Glycerol. Stored in 4°C | ||
1x BRB-80 | 80 mM PIPES pH 6.9; 1 mM EGTA; 1 mM MgCl2 | ||
White Light Source | Lumencor Inc | ||
ET EGFP Filter Cube | Chroma | 49002 | |
DSRed Filter Cube | Chroma | 49005 | |
anti-NDC80 antibody | Custom made by the Maresca Lab | ||
DM1α (anti-α-tubulin) | Sigma | T6199 | |
anti-CID antibody | AbCam | ab10887 |