This protocol describes how to generate a Drosophila S2 cell line that is sensitive to small molecule inhibitors of kinesin-5. The use of these cells in a cell-based error correction assay is also outlined.
Kinetochores are large protein-based structures that assemble on centromeres during cell division and link chromosomes to spindle microtubules. Proper distribution of the genetic material requires that sister kinetochores on every chromosome become bioriented by attaching to microtubules from opposite spindle poles before progressing into anaphase. However, erroneous, non-bioriented attachment states are common and cellular pathways exist to both detect and correct such attachments during cell division. The process by which improper kinetochore-microtubule interactions are destabilized is referred to as error correction. To study error correction in living cells, incorrect attachments are purposely generated via chemical inhibition of kinesin-5 motor, which leads to monopolar spindle assembly, and the transition from mal-orientation to biorientation is observed following drug washout. The large number of chromosomes in many model tissue culture cell types poses a challenge in observing individual error correction events. Drosophila S2 cells are better subjects for such studies as they possess as few as 4 pairs of chromosomes. However, small molecule kinesin-5 inhibitors are ineffective against Drosophila kinesin-5 (Klp61F). Here we describe how to build a Drosophila cell line that effectively replaces Klp61F with human kinesin-5, which renders the cells sensitive to pharmacological inhibition of the motor and suitable for use in the cell-based error correction assay.
L'égalité de ségrégation du génome pendant la division cellulaire nécessite des interactions entre l'ADN correctes et broche microtubules répliquées. Microtubules interagissent physiquement avec des chromosomes à travers un ensemble de protéines qui se réunit à centromères connus sous le nom kinetochore 1. La distribution correcte des chromosomes exige que cinétochores sœurs sont bi-orienté, dans lequel chaque sœur est associée à des microtubules provenant opposées pôles du fuseau. Kinetochore microtubules (kt-MT) les pièces jointes qui ne sont pas dans la conformation biorienté sont rapidement et efficacement déstabilisé de fournir l'occasion d'établir biorientation dans un processus connu sous le nom de correction d'erreur. Un essai de correction d'erreur qui a été précédemment mis en place dans des cellules de mammifère 5 nécessite l'assemblage des fuseaux monopolaires utilisant des inhibiteurs de petites molécules contre réversibles Eg5 (kinésine-5). Le traitement de la toxicomanie génère une multitude de pièces jointes syntelic erronées dans lequel botcinétochores h sœurs attachent à la même pôle broche. Un lavage subséquent du médicament permet une visualisation du processus de correction d'erreur. L'essai de correction d'erreur peut être fait en présence d'inhibiteurs de petites molécules ou des passes rabattues pour étudier la contribution des protéines candidates à corriger erronées pièces jointes kt-MT.
La capacité à visualiser la correction d'erreurs dans les cellules vivantes est un outil puissant pour mieux comprendre le mécanisme moléculaire impliqué dans ce processus complexe. Toutefois, le grand nombre de chromosomes présents dans la plupart des lignées de cellules constitue un défi en observant individuelles jointes kt-MT. Des cellules de Drosophila S2, il est idéal pour l'application de l'essai de correction d'erreur, car ils contiennent aussi peu que quatre chromosomes 6, mais de petites molécules inhibitrices de kinésine 5 tels que S-trityl-L-cystéine (STLC) et Monastrol 7-9 ne touchent pas ensemble broche ou kinésine-5 fonction motrice dans les cellules de drosophile. Nous avons donc genresTed une lignée de cellules de Drosophila S2 exprimant kinésine-5 humain sous un promoteur inductible qui est sensible à la kinésine-5 inhibiteurs. Ce protocole décrit comment le knockdown endogène Drosophila kinésine-5 homologue, Klp61F, et en utilisant cette lignée cellulaire dans l'essai de correction d'erreur basé sur des cellules.
Visualisation correction d'erreur est une technique précieuse pour étudier les étapes impliquées dans ce processus cellulaire importante et complexe. Pour ce faire, les pièces jointes erronées sont générées en utilisant des inhibiteurs réversibles, et la correction d'erreur est observée sur lavage de la drogue. Cet essai a été développé à l'origine en utilisant des cellules de culture de tissu de mammifère 5. Cependant, la présence d'un grand nombre de cinétochores dans de nombreux types de cellules de mammifères modèle pose un défi à l'observation des événements individuels de correction d'erreur. Des cellules de Drosophila S2 possèdent aussi peu que 4 paires de cinétochores, ce qui en fait une lignée cellulaire plus préférable pour l'observation de correction d'erreur. Cependant, un inconvénient majeur est que de nombreux inhibiteurs ne sont pas efficaces dans des cellules S2 de Drosophila. Ainsi, la capacité de générer une lignée de cellules de Drosophila S2 humanisé exprimant kinésine-5 humaine constitue un outil précieux pour étudier la correction d'erreur.
Bien que les cellules S2 de Drosophila peuvent être unmeilleure lignée cellulaire pour étudier la correction d'erreur, les multiples étapes nécessaires à l'obtention de la lignée cellulaire et abattre des gènes essentiels pose des défis à cette technique. Par exemple, l'efficacité de transfection peut être très faible. Si moins de 20% des cellules expriment la Eg5-mCherry, la transfection doit être répété que le processus de sélection prendra plus de temps. En outre, le pourcentage de cellules exprimant deux protéines fluorescentes peut diminuer au fil du temps. Ceci peut être surmonté en fractionnant des cellules en présence de HCl et la blasticidine S hygromycine B pour sélectionner des cellules exprimant Eg5-mCherry et GFP-α-tubuline, respectivement. Il est également important de noter que les cellules S2 de Drosophila ont orthologues de nombreuses protéines humaines et; par conséquent, il est essentiel d'optimiser les conditions démontables pour les protéines endogènes. Knockdown conditions optimales peuvent varier de la quantité de l'ARN double brin et la durée du traitement. Considérant l'émergence et l'amélioration rapide de CRISPR-cas9 technologies 15 à 17, la génération d'une lignée de cellules de Drosophila avec le gène remplacé par Klp61F Eg5 humain présente une alternative puissante que permettrait de surmonter les limitations de l'approche et la transfection effet de choc. Notre travail démontre que la mouche à humain remplacement d'un gène doit être une option viable dans ce cas, bien que les réactifs nécessaires pour le faire dans les cellules S2 de drosophile sont actuellement en cours d'élaboration.
Ce procédé ne se limite pas à Eg5, mais peut être appliquée pour étudier la fonction d'autres protéines d'intérêt. Si l'utilisation d'inhibiteurs qui ont déjà été mis en place pour être inefficace dans les cellules S2 de drosophile, ce protocole peut être modifié pour étudier l'effet direct des inhibiteurs dans des cellules vivantes, sans crainte des effets hors cible. La lignée cellulaire produit en utilisant ce protocole pourrait également être utilisé dans le criblage à haut débit des analyses pour identifier les médicaments potentiels ciblant les protéines impliquées dans la correction d'erreur.
The authors have nothing to disclose.
Nous tenons à remercier Patricia Wadsworth pour le don de la kinésine-5 construction. Ce travail a été soutenu par une subvention du NIH (5 R01 GM107026) de TJM et par une subvention de recherche n ° 5 FY13-205 de la Mars de Dimes Foundation de TJM, ainsi que le soutien de la Fondation Charles H. capot, Inc., Boston, MA. à TJM
Effectine Transfection Reagent | Qiagen | 301425 | |
Klp61F cDNA | Drosophila Genomic Resource Center | 13690 | Gene Name LD15641 |
Schneider’s Media | Invitrogen | 21720-024 | |
Fetal Bovine Serum, certified | Invitrogen | 10082-147 | Heat Inactivated, US origin |
Copper (II) Sulfate (CuSO4) | Sigma | C8027-500G | 500mM stock |
S-trityl-l-cysteine | Sigma | 164739-5G | 1mM stock in DMSO |
Blasticidin HCl | Invitrogen | R21001 | 5mg/ml stock in 1x PBS |
Hygromycin B | Invitrogen | 10687010 | |
T7 Large scale RNA Production System | Promega | P1320 | The approximate dsRNA concentration from each reaction is about 5-15µg/µl |
Klp61F RNAi F primer | Invitrogen | TAATACGACTCACTATAGGGTA-TTTGCGCATTATTTTAAAA | |
Klp61F RNAi R primer | Invitrogen | TAATACGACTCACTATAGGGAT-ATTGATCAATTGAAAC | |
PCR clean-up kit | Mo Bio Laboratories, Inc | 1250 | |
Concanavalin A | Sigma | C5275 | 0.5mg/ml solution made by dissolving in 1xPBS. |
Boiled Donkey Serum | Jackson ImmunoResearch Labs | 017-000-121 | 5% stock solution in 1X PHEM buffer, bring solution up to boil. Stored in 4°C. |
Mounting Media | 20mM Tris pH 8.0, 0.5% N-propyl gallate, 90% Glycerol. Stored in 4°C | ||
1x BRB-80 | 80 mM PIPES pH 6.9; 1 mM EGTA; 1 mM MgCl2 | ||
White Light Source | Lumencor Inc | ||
ET EGFP Filter Cube | Chroma | 49002 | |
DSRed Filter Cube | Chroma | 49005 | |
anti-NDC80 antibody | Custom made by the Maresca Lab | ||
DM1α (anti-α-tubulin) | Sigma | T6199 | |
anti-CID antibody | AbCam | ab10887 |