Bioprinting細胞化は、組織特異的ヒドロゲルBioinkを使用して構築します

Summary

我々は、一緒に機能し、生存可能な3次元組織構築物はインビトロスクリーニング用途に使用するためbioprinted可能な組織を模倣ヒドロゲルbioinkを提供するプロトコルのセットを記述する。

Abstract

Bioprinting has emerged as a versatile biofabrication approach for creating tissue engineered organ constructs. These constructs have potential use as organ replacements for implantation in patients, and also, when created on a smaller size scale as model “organoids” that can be used in in vitro systems for drug and toxicology screening.

Despite development of a wide variety of bioprinting devices, application of bioprinting technology can be limited by the availability of materials that both expedite bioprinting procedures and support cell viability and function by providing tissue-specific cues. Here we describe a versatile hyaluronic acid (HA) and gelatin-based hydrogel system comprised of a multi-crosslinker, 2-stage crosslinking protocol, which can provide tissue specific biochemical signals and mimic the mechanical properties of in vivo tissues.

Biochemical factors are provided by incorporating tissue-derived extracellular matrix materials, which include potent growth factors. Tissue mechanical properties are controlled combinations of PEG-based crosslinkers with varying molecular weights, geometries (linear or multi-arm), and functional groups to yield extrudable bioinks and final construct shear stiffness values over a wide range (100 Pa to 20 kPa). Using these parameters, hydrogel bioinks were used to bioprint primary liver spheroids in a liver-specific bioink to create in vitro liver constructs with high cell viability and measurable functional albumin and urea output. This methodology provides a general framework that can be adapted for future customization of hydrogels for biofabrication of a wide range of tissue construct types.

Introduction

近年では、様々な技術は、それらを製造し、またはbiofabricateしようとしていることにより、機能の臓器や組織の代替エネルギー源の必要性に対処し、その利用可能になっています。 Bioprintingは、これらの技術の最も有望なの一つとして浮上しています。 Bioprintingが3次元でパターン生存器官状又は組織様構造を構築したりするために使用することができる生物学的部品のロボット添加剤製造の形態と考えることができる。多くの場合^{1、bioprinting} 3（3次元を使用しますこれにより、解剖学的に模倣生理的なアーキテクチャを反復する、正確な位置への細胞や生体材料を堆積するために、コンピュータによって指示される-D）印刷装置^。2これらのデバイスは、細胞凝集体の形態をとることができる「bioink」を、印刷、ヒドロゲルに封入された細胞または粘性流体、または細胞を播種したマイクロキャリア、ならびに無細胞PLAのような機械的な構造または行為を提供する無細胞ポリマーceholders ^3,4 bioprintingプロセスに続いて、得られた構造は、機能的な組織または器官の構造体へと成長することができ、その意図された最終用途に使用される^。5,6日に、完全な完全に機能する人間サイズの器官が印刷されていません、しかし、それは研究開発をbioprintingの主要な長期にわたる目標である^。2しかし、「オルガノイド「組織構築物は、現在病理学モデリング、薬剤開発、および毒性スクリーニングなどのアプリケーションの数に実装されている小規模な。

研究者はbioprinting技術を適用する際に発生した主な障害の1つは、非常にいくつかの材料がbioprintingの明示的な目的のために開発されているということです。効果的bioprintingで成功するために、生体材料は、4つの基本要件を満たす必要があります。生体材料の堆積を可能にする1）適切な機械的特性を有する必要がある（これは、ゲルまたはIのようなノズルを通して押し出すこと液滴としてnkjet）堆積後の3-D構造の構成要素としてその形状を保持するために、2）能力、3）2前の特性のユーザ制御、および4）セルフレンドリーで協力的な環境では、すべてのための機能bioprinting手順の段階^。7歴史的には、仕事をbioprintingことが多い代わりにbioprintingとその後のポスト印刷用途に必要な性質を持っている生体材料の設計、彼らの互換性を考慮せずにbioprintingデバイス内の既存の伝統的な生体材料を採用しようとしています。

bioinksの様々な堆積および製造ハードウェアとのより良いインタフェースに最近開発されてきました。彼らは一般的にどちらかの前駆体として不十分な機械的特性、または場合はノズルを詰まらせることができます印刷または押出プロセス時に壊れなっ重合ヒドロゲルと流体ソリューションを存在するため、標準的なハイドロゲルシステムは、重大な問題を提起します。私たちのチームだけでなく、パーソナルプラグインRSは、ヒドロゲル基質への細胞スフェロイド印刷、マイクロキャピラリーチューブから^5,8セルとハイドロゲルフィラメント押し出し、動的架橋特性を有する^9-11押出可能なヒアルロン酸（HA） -金ナノ粒子ヒドロゲルを含むこれらのbioprinting問題に対処するために、様々なハイドロゲル製剤を、模索しています、光重合性を使用して、ハイドロゲル剛性の¹²時間的制御は^、17 HAおよびゼラチン^、13フィブリノゲン-トロンビン系架橋^、14,15のイオン交換アルギン酸-コラーゲンゲル^、16をメタクリル化し、最近の急速な重合紫外線（UV）-initiated架橋

これらの例は、によって効果的にbioprintedことができる材料を生成することの実現可能性を実証します。しかし、成功した生存可能で機能的な3次元組織構築物を生成する、ハードウェアとの統合に加えて、生体材料は、細胞の維持に援助することを生化学的および機械的な手がかりが含まれている必要があります生存率および機能。これらの付加的な要因、生化学的および機械的なプロファイルは、bioprinted組織構築の成功の機能に大きな影響を持つことができます。

両方の細胞およびネイティブ細胞外マトリックス（ECM）は、成長因子および他の細胞の他のサイトカインなどのシグナル伝達分子の広い範囲を提示する責任があります。これらの信号の組み合わせは、組織への組織によって異なりますが、細胞や組織の行動を調節するのに非常に強力で影響力のあることができる^。18で検討されている異なる器官からの組織特異的なECM成分を採用し、ヒドロゲルとして、またはヒドロゲルの一部として実装します、与えられた組織を脱細胞化して粉砕し、それを溶解から構成されている成功^。19-21このアプローチは、任意の組織からの組織特異的生化学的シグナルを生成するために使用することができ、3次元ヒドロゲル構築物に組み込むことができる^。22

さらに、それは広く、体内の組織は剛性の広い範囲を占めることが文書化されている。このように^23、調整する能力、そのような弾性率E 'または剪断弾性率G'のような生体材料の機械的特性は、組織工学における有用なツールであります。上述したように、bioink機械的性質の制御は、次いで、さらに弾性率のレベルは標的臓器の種類のものと一致する達成可能な後の時点にて二次架橋することによって操作することができ、ソフトゲルを用いた押出によるbiofabricationを可能にします。例えば、生体材料は、天然の肝臓^、23のように5〜10キロパスカルの剛性を一致させるか、理論的には^24,25の中に機能するこれらのオルガノイドの能力を増加させ、ネイティブの心臓組織のような10〜15キロパスカルの剛性と一致するようにカスタマイズすることができましたその天然の組織の対応と同様に。細胞表現型への環境剛性の影響はEXPとなっています特に幹細胞については、近年lored。エングラーら基板弾性が基板のそれに一致する組織の弾力性と系統に向かって間葉系幹細胞（MSC）の駆動に支援することを実証した^。25この概念はさらに、筋肉、心臓機能、肝表現型、造血幹細胞の増殖への分化のために検討されています、および幹細胞治療可能性の維持^{。24,26-29が}同調することができることは、異なる弾性率のヒドロゲルは、組織構築物をbiofabricateするために使用される生体材料の重要な特徴である^。30

ここでは、押出bioprintedできるヒドロゲル系を処方するために我々の研究室で使用される汎用性の高いアプローチを示し、特定の組織型の生化学的プロフィールを含み、2）その組織タイプの弾性率を模倣する、1）、カスタマイズプロトコルを記述する。これらの要件に対処することにより、我々は、pに目指しますin vivoでの物理化学的および生物学的特性を再現することができる材料をrovide組織^。31は、本明細書^に記載^のモジュール式のハイドロゲル複合システムは、押出可能のbioinksを得るために、マルチ架橋アプローチを活用し、安定させる二次架橋を可能にし、剛性を増加させます最終生成物は、組織タイプの範囲と一致します。生化学的なカスタマイズは、組織特異的なECM成分を使用することによって満たされます。デモンストレーションとして、我々は機能的肝オルガノイドの構築をbioprintするために、このヒドロゲル系の肝特異的多様性を採用しています。記載されているプロトコルは、カスタムの3-D bioprintingデバイスを使用しています。一般に、このプロトコルは、ほとんどの押出によるプリンタに適合させることができる、特定の印刷パラメータは、デバイスの種類ごとに劇的に変化し、ユーザによる検査を必要とします。

Protocol

1.ハイドロゲルBioink製剤と準備先に肝臓に記載のようなソリューションをダイジェスト、組織特異的な生化学的プロフィールを提供する組織特異ECMを調製するために、20 注意：一般的には、このECMダイジェストが使用される最終的なヒドロゲルbioink体積の40％を含むであろう。 ECM消化溶液の数百ミリリットルを調製等分し、そして将来の使用のために-80℃で凍結すること?…

Representative Results

上記の手順が正しく実行されると、ヒドロゲルは、標的組織型に特異的な生化学的プロファイルが含まれている必要があり、20は bioprintingと、最終的な弾性率、34を超える高度の制御を可能にし、組織構築物中の生存機能セルをサポートしています。 ハイドロゲルのカスタマイズ 最良模?…

Discussion

ヒトでまたはin vitroスクリーニングアプリケーションのための最終的な使用のために、3次元組織構築をbiofabricateしようとしたときに考慮することが重要であるいくつかのコンポーネントがあります。 biofabricationデバイス自体が終了コンストラクトに到達するための一般的な方法論を決定しながら、適切な細胞成分を採用することにより、エンド潜在的な機能性を決定します。それは二?…

Materials

Hyaluronic acid	Sigma	53747
Gelatin	Sigma	G6144
2-Hydroxy-4′-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone	Sigma	410896
Hyaluronic acid and gelatin hydrogel kit (HyStem-HP)	ESI-BIO	GS315	Kit contains the components Heprasil (thiolated and heparinized hyaluronic acid), Gelin-S (thiolated gelatin), and Extralink (PEGDA)
PEG 8-Arm Alkyne, 10 kDa	Creative PEGWorks	PSB-887
Primary human hepatocytes	Triangle Research Labs	HUCPM6
Primary human liver stellate cells	ScienCell	5300
Primary human Kupffer cells	Life Technologies	HUKCCS
Hepatocyte Basal Media (HBM)	Lonza	CC-3199
Hepatocyte Media Supplement Kit	Lonza	CC-3198	HCM SingleQuot Kits (contains ascorbic acid, 0.5mL; bovine serum albumin [fatty acid free], 10 mL; gentamicin sulfate/amphotericin B, 0.5mL; hydrocortisone 21-hemisuccinate, 0.5 mL; insulin, 0.5 mL; human recombinant epidermal growth factor, 0.5 mL; transferring, 0.5 mL)
Triton X-100	Sigma	T9284	Other manufacturers are ok.
Ammonium hydroxide	Fischer Scientific	A669	Other manufacturers are ok.
Fresh porcine cadaver tissue	n/a	n/a
Lyophilizer	any	n/a
Freezer mill	any	n/a
Bioprinter	n/a	n/a	The bioprinter described herein was custom built in-house. In general, other devices are adequate provided they support computer controlled extrusion-based printing of hydrogel materials.
Hanging drop cell culture plate	InSphero	CS-06-001	InSphero GravityPlus 3D Culture Platform