C-FOS Protein Immunohistologisk Detection: Et nyttigt værktøj som en markør for Central involverede veje i specifikke fysiologiske reaktioner<em> In vivo</em> og<em> Ex vivo</em

Summary

Here, we present a protocol based on c-FOS protein immunohistological detection, a classical technique used for the identification of neuronal populations involved in specific physiological responses in vivo and ex vivo.

Abstract

Mange undersøgelser søge at identificere og kortlægge områder af hjernen, der er involveret i specifikke fysiologiske regler. Proto-onkogen c-fos, en umiddelbart tidlig gen, udtrykkes i neuroner som reaktion på forskellige stimuli. Proteinproduktet kan let detekteres med immunhistokemiske teknikker fører til anvendelsen af ​​c-fos detektion til kort grupper af neuroner, der viser ændringer i deres aktivitet. I denne artikel, vi fokuseret på identifikation af hjernestamme neuronal befolkninger er involveret i ventilatorisk tilpasning til hypoxi eller hyperkapni. To tilgange blev beskrevet at identificere involverede neuronale populationer in vivo i dyr og ex vivo i deafferented hjernestamme præparater. In vivo blev dyr udsat for Hyperkapni eller hypoxiske gasblandinger. Ex vivo blev deafferented præparater overhældt med hypoxiske eller Hyperkapni kunstig cerebrospinalvæske. I begge tilfælde, enten kontrol in vivo dyr eller ex vivo præparater blev holdt under normoxiske og normocapnic betingelser. Sammenligningen af disse to tilgange muliggør bestemmelse af oprindelsen af den neuronale aktivering dvs, perifer og / eller central. In vivo og ex vivo blev brainstems indsamlet, fast, og skåret i sektioner. Når sektioner blev fremstillet, blev immunhistokemisk detektion af c-fos-proteinet foretaget for at identificere hjernestammen grupper af celler aktiveret af hypoxiske eller Hyperkapni stimuleringer. Mærkede celler blev talt i hjernestamme respiratoriske strukturer. I sammenligning med kontrolgruppen tilstand, hypoxi eller hyperkapni øget antallet af c-FOS mærkede celler i flere specifikke hjernestamme websteder, der er således konstituerende for de nervebaner, der er involveret i tilpasningen af ​​den centrale respiratoriske drev.

Introduction

Den c-fos-genet blev identificeret for første gang i begyndelsen af 1980 ^1,2 og dets produkt blev karakteriseret i 1984 som en nuklear protein, der har gen-aktivator egenskaber ^3,4. Den deltager i langsigtede mekanismer forbundet med neuron stimulering. Faktisk ændringer i neuronal aktivitet føre til andre messenger signaleringskaskader, der inducerer ekspressionen af de umiddelbare tidlige gen c-fos, der inducerer produktionen af transkriptionsfaktoren c-fos. Sidstnævnte initierer ekspressionen af sene gener og dermed deltager i adaptive responser i nervesystemet til mange forskellige typer af stimuli ^4. Således eftersom udgangen af 1980 ^5,6, c-fos-proteinet afsløring er ofte blevet anvendt til at undersøge virkningerne af eksogene faktorer på gentranskription generelt ⁴ og på aktiviteten af det centrale nervesystem (CNS) til kortlægning ud nervebaner involveret i forskellige fysiologiskeal forhold.

Basal c-fos udtryk er blevet undersøgt i forskellige arter, herunder mus, rotte, kat, abe og menneske ^4. Derved kinetik sit udtryk forholdsvis velkendt. Transkriptionsaktiveringsdomæne er hurtig (5 til 20 min) ^7,8, og mRNA akkumulering når et maksimum mellem 30 og 45 min efter indtræden af stimulering ⁹ og falder med en kort halveringstid på 12 min. C-FOS-proteinsyntese følger mRNA akkumulering og kunne påvises ved immunhistokemi på 20 til 90 minutter efter stimulering ^6.

Analyse af c-fos-ekspression er klassisk anvendes i in vivo-undersøgelser for at identificere den centrale respiratorisk netværk involveret i ventilatoriske reaktioner på hypoksi eller hyperkapni ^10-14. For nylig blev dette værktøj også brugt i ex vivo hjernestamme forberedelser til at udforske centrale respiratoriske netværk tilpasninger til hypoxi eller hypercapnia ^15-18. Faktisk er disse præparater generere en rytmisk aktivitet klassisk sidestilles med den centrale respiratoriske drev ^19. Denne type præparat har således den fordel, at helt deafferented, og derfor resultater med hensyn c-fos udtryk kun afspejle konsekvenserne af en central stimulation uden indgriben af perifere strukturer.

C-FOS detektering kan foretages ved immunohistokemiske eller immunohistofluorescence tilgange. Indirekte immunpåvisning nødvendiggør anvendelsen af ​​et primært antistof mod c-fos og et sekundært antistof rettet mod arter, hos hvilke det primære antistof blev produceret. For den immunhistokemiske metode er det sekundære antistof konjugeret med et enzym (peroxidase, for eksempel), der virker på et substrat (H ₂ O ₂ til peroxidase). Produktet fra den enzymatiske reaktion er udviklet af et chromogen (3,3-diaminobenzidin tetrahydrochloride), der farver det og kan iagttages under lysmikroskopi. Reaktionen kan styrkes ved hjælp af nikkel ammoniumsulfat. Disse metoder muliggør påvisning af Actives neuroner under forskellige fysiologiske udfordringer, og derfor identifikation og / eller kortlægning af perifere og centrale involverede veje i de efterfølgende fysiologiske reaktioner.

Protocol

Bemærk: c-fos påvisning er en standardiseret procedure, der omfatter flere trin (figur 1). Alle eksperimenter blev udført på rotter eller mus. Eksperimentelle protokoller blev godkendt af den etiske komité i dyreforsøg Charles Darwin (CE5 / 2011/05), sker i overensstemmelse med De Europæiske Fællesskabers direktiv af September 22, 2010 (2010/63 / EU) for dyr pleje, og udføres i overensstemmelse med franske love for dyr pleje. 1. Fremstilling af opløsninger <l…

Representative Results

C-FOS påvisning er et nyttigt værktøj, der tillader identifikation grupper af aktiverede celler under specifikke betingelser, såsom hypoksi og hyperkapni in vivo (figur 2A) eller i situationer, der efterligner disse betingelser ex vivo (figur 2B). In vivo, nyfødt, ung eller voksne gnavere blev anbragt i en lufttæt kasse, som det gasformige miljø kontinuerligt fornyet ved en gasblanding med et præparat præcist defineret…

Discussion

C-fos er et umiddelbart tidligt gen, og påvisningen af det produkt, c-FOS-protein, er klassisk anvendes til at identificere neuronale populationer involveret i specifikke respiratoriske responser in vivo ^11,13,25,28 og ex vivo ^{16-18, 27,32,33.}

Kritiske skridt i protokollen

Vær forsigtig under perfusion trin. De 4% PFA løsning skal være godt forberedt og fiksering og post-fikse…

Materials

Cell culture plate 12-Well	Costa	35/3
15 mm Netwell inserts with mesh polyester membrane	Corning	3477	The 15mm diameter well inserts have 74µm polyester mesh bottoms attached to polystyrene inserts
primary antibody (rabbit polyclonal antibody against the c-Fos protein)	Santa Cruz Biotechnology	sc-52
Vectastain Elite ABC KIT	Vector laboratories	PK-6101
(Rabbit IgG-secondary antibody)
NaH2PO4*2H2O	Sigma	71505
Na2HPO4	Sigma	S7907
Paraformaldehyde	Sigma	P6148
NaOH 0.1N	Sigma	43617
Polyvinyl-Pyrrolidone	Sigma	PVP-360
Sucrose	Sigma	S7903
NaCl	Sigma	S7653
Ethylene-glycol	Sigma	33068
Triton X100	Sigma	T8787
Trisma HCl	Sigma	T5941
Trisma Base	Sigma	T1503
3.3-diaminobenzidine tetrahydrochloride	Rockland	DAB50
Nickel ammonium sulphate	Alfa Aesar	12519
H2O2	Sigma	H1009
Xylene	Sigma	33817
Entellan Neo	Merck Millipore	107961
Slide	Thermo-scientific	1014356190	Superfrost ultraplus
Cover glass	Thermo-scientific	Q10143263NR1	24 x 60mm
BSA	Sigma	A2153