Die c-fos-Protein Immunohistologische Nachweis: Ein nützliches Werkzeug als Marker der Mittelwegen beteiligt sind in spezifischen physiologischen Antworten<em> In Vivo</em> und<em> Ex Vivo</em
Summary
Here, we present a protocol based on c-FOS protein immunohistological detection, a classical technique used for the identification of neuronal populations involved in specific physiological responses in vivo and ex vivo.
Abstract
Viele Studien versuchen, die Hirnregionen in spezifischen physiologischen Vorschriften beteiligt zu identifizieren und abzubilden. Die Proto-Onkogens c-fos, eine immediate early – Gen wird in Neuronen in Reaktion auf verschiedene Stimuli exprimiert. Das Proteinprodukt kann leicht mit immunhistochemischen Techniken nachgewiesen werden, um die Verwendung von c-fos Detektions führenden Gruppen von Neuronen zu kartieren, die Änderungen in ihrer Aktivität. In diesem Artikel konzentrieren wir uns auf die Identifizierung von brainstem neuronalen in der ventilatory Anpassung an Hypoxie oder Hyperkapnie beteiligt Populationen. Zwei Ansätze wurden beschrieben beteiligt neuronale Populationen in vivo bei Tieren zu identifizieren und ex vivo in deafferentierten brainstem Zubereitungen. In vivo wurden die Tiere ausgesetzt hyperkapnischen oder hypoxischen Gasgemischen. Ex vivo wurden deafferentierten Präparate superfused mit hypoxischen oder hyperkapnischen künstliche Zerebrospinalflüssigkeit. In beiden Fällen entweder in vivo Kontrolle Tieren oder ex – vivo – Präparate wurden unter normoxischen und normocapnic Bedingungen gehalten. Der Vergleich dieser beiden Ansätze ermöglicht die Bestimmung des Ursprungs des neuronalen Aktivierungs dh peripheren und / oder zentralen. In vivo und ex vivo, brainstems wurden gesammelt, fixiert und in Abschnitte geschnitten. Sobald Abschnitte hergestellt, immunhistochemischen Nachweis des c-fos-Protein wurde gemacht, um die brainstem Gruppen von Zellen durch Hypoxie oder hyperkapnischen Stimulationen aktiviert zu identifizieren. Markierten Zellen wurden in brainstem Atmungsstrukturen gezählt. Im Vergleich zu der Kontrollgruppe, Hypoxie oder Hyperkapnie erhöhte die Anzahl der c-Fos markierten Zellen in mehreren spezifischen brainstem Websites, die damit konstitutiv für den neuronalen Bahnen bei der Anpassung des zentralen Atemantrieb beteiligt sind.
Introduction
Das c – fos – Gen wurde zum ersten Mal am Anfang des Jahres 1980 1,2 und ihr Produkt wurde im Jahr 1984 als ein Kernprotein mit Gen-Aktivator Eigenschaften 3,4 charakterisiert identifiziert. Er beteiligt sich an Mechanismen langfristigen Zusammenhang mit Neuron Stimulation. Tatsächlich Veränderungen in der neuronalen Aktivität führen zu second messenger Signalkaskaden, die die Expression der immediate early – Gens c-fos induziert, die die Produktion des Transkriptionsfaktors c-fos induziert. Der letztere veranlasst die Expression der späten Gene und nimmt somit in adaptive Reaktionen des Nervensystems auf viele verschiedene Arten von Stimuli 4. Da somit Ende 1980 5,6, c-Fos Protein – Nachweis häufig verwendet wurde , in der Regel 4 und auf die Aktivität des zentralen Nervensystems (ZNS) zum Abbilden aus neuronalen Bahnen die Wirkungen von exogenen Faktoren auf die Gentranskription zu studieren in verschiedenen physiologischen beteiligtal Bedingungen.
Basal c-fos – Expression wurde 4 in verschiedenen Arten , darunter Mäuse, Ratten, Katze, Affe und Mensch untersucht. Dadurch wird die Kinetik seiner Expression relativ gut bekannt. Die Transkriptionsaktivierung ist schnell (5 bis 20 min) 7,8, und die mRNA Akkumulation erreicht ein Maximum zwischen 30 und 45 min nach dem Beginn der Stimulation 9 und nimmt mit einer kurzen Halbwertszeit von 12 min. Die c-fos – Protein – Synthese folgt Akkumulation mRNA und konnte durch Immunhistochemie bei 20 bis 90 Minuten nach der Stimulation 6 nachgewiesen werden.
Analyse der c-fos – Expression wird in in vivo Studien klassisch verwendet , um die zentrale respiratorische Netzwerk in den ventilatory Reaktionen auf Hypoxie oder Hyperkapnie 10-14 beteiligt zu identifizieren. Vor kurzem wurde dieses Tool auch in ex vivo brainstem Zubereitungen verwendet zentralen Atem Netzwerk Anpassungen an Hypoxie oder h zu erkundenypercapnia 15-18. Tatsächlich erzeugen diese Präparate eine rhythmische Aktivität klassisch 19 an den zentralen Atemantrieb assimiliert. Somit hat diese Art der Herstellung den Vorteil, dass vollständig deafferentierten und daher Ergebnisse hinsichtlich c-fos – Expression nur die Folgen einer zentralen Stimulation ohne Eingreifen von peripheren Strukturen reflektieren.
Die c-fos-Nachweis konnte durch immunhistochemische oder immunohistofluorescence Ansätze gemacht werden. Indirekte Immunnachweis erfordert die Verwendung eines primären Antikörpers gegen c-fos und einem sekundären Antikörper, der gegen die Spezies gerichtet ist, in welcher der primäre Antikörper produziert wurde. Für die immunhistochemische Verfahren wird der sekundäre Antikörper mit einem Enzym konjugiert (Peroxidase, zum Beispiel) , die auf einem Substrat (H 2 O 2 für die Peroxidase) wirkt. Das Produkt der Enzymreaktion wird durch ein Chromogen (3,3-Diaminobenzidin entwickelt tetrahydrochloride), die Flecken es und kann unter Lichtmikroskopie beobachtet werden. Die Reaktion konnte verstärkt werden Nickelammoniumsulfat. Diese Verfahren erlauben den Nachweis von aktiven Neuronen in verschiedenen physiologischen Herausforderungen und daher die Identifizierung und / oder die Zuordnung der peripheren und zentralen Leitungsbahnen in den aufeinanderfolgenden physiologischen Reaktionen beteiligt.
Protocol
Representative Results
Discussion
C-fos ist ein immediate early – Gen, und die Detektion ihres Produkts, die c-fos – Protein, verwendet wird klassisch neuronaler Populationen in spezifischen Atemwegsantworten in vivo und ex vivo 11,13,25,28 16-18 beteiligt zu identifizieren, 27,32,33.
Kritische Schritte innerhalb des Protokolls
Seien Sie während des Perfusionsschritt vorsichtig. Die 4% PFA-Lö…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The University Paris 13 supported this work. ASPT was supported by a University Paris 13 fellowship and the “Association Française pour le Syndrome d’Ondine”. FJ was supported by a Laboratory of Excellence GR-Ex fellowship. The GR-Ex (ref ANR-11-LABX-0051) is funded by the program “Investissement d’avenir” of the French National Research agency (ref ANR-11-IDEX-0005-02).
Materials
| Cell culture plate 12-Well | Costa | 35/3 | |
| 15 mm Netwell inserts with mesh polyester membrane | Corning | 3477 | The 15mm diameter well inserts have 74µm polyester mesh bottoms attached to polystyrene inserts |
| primary antibody (rabbit polyclonal antibody against the c-Fos protein) | Santa Cruz Biotechnology | sc-52 | |
| Vectastain Elite ABC KIT | Vector laboratories | PK-6101 | |
| (Rabbit IgG-secondary antibody) | |||
| NaH2PO4*2H2O | Sigma | 71505 | |
| Na2HPO4 | Sigma | S7907 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| NaOH 0.1N | Sigma | 43617 | |
| Polyvinyl-Pyrrolidone | Sigma | PVP-360 | |
| Sucrose | Sigma | S7903 | |
| NaCl | Sigma | S7653 | |
| Ethylene-glycol | Sigma | 33068 | |
| Triton X100 | Sigma | T8787 | |
| Trisma HCl | Sigma | T5941 | |
| Trisma Base | Sigma | T1503 | |
| 3.3-diaminobenzidine tetrahydrochloride | Rockland | DAB50 | |
| Nickel ammonium sulphate | Alfa Aesar | 12519 | |
| H2O2 | Sigma | H1009 | |
| Xylene | Sigma | 33817 | |
| Entellan Neo | Merck Millipore | 107961 | |
| Slide | Thermo-scientific | 1014356190 | Superfrost ultraplus |
| Cover glass | Thermo-scientific | Q10143263NR1 | 24 x 60mm |
| BSA | Sigma | A2153 |
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