C-FOS Protein Immunohistologisk Detection: Et nyttig verktøy som en markør av Central Pathways involvere seg i det fysiologiske responser<em> I Vivo</em> og<em> Ex Vivo</em

Summary

Here, we present a protocol based on c-FOS protein immunohistological detection, a classical technique used for the identification of neuronal populations involved in specific physiological responses in vivo and ex vivo.

Abstract

Mange studier søker å identifisere og kartlegge områder av hjernen som er involvert i konkrete fysiologiske forskrifter. Proto-oncogenet c-fos, en umiddelbar tidlig genet, blir uttrykt i nerveceller i respons til forskjellige stimuli. Proteinproduktet kan lett påvises med immunohistokjemiske teknikker som fører til bruken av c-fos deteksjon for å kartlegge grupper av neuroner som viser forandringer i deres aktivitet. I denne artikkelen har vi fokusert på identifisering av hjernestammen nevronale populasjoner som er involvert i ventilasjons tilpasning til hypoksi eller hyperkapni. To tilnærminger ble beskrevet til å identifisere involverte neuronpopulasjoner in vivo hos dyr og ex vivo i deafferented hjernestammen forberedelser. In vivo, dyrene ble utsatt for gassblandinger Hyperkapni eller hypoksiske. Ex vivo, deafferented forberedelser ble superfuseres med hypoksisk eller Hyperkapni kunstig spinalvæske. I begge tilfeller, enten kontroll in vivo dyr eller ex vivo forberedelser ble opprettholdt under normoksisk og normocapnic forhold. Sammenligningen av disse to fremgangsmåter gjør det mulig å bestemme opprinnelsen til den neuronale aktiverings ie, perifere og / eller sentral. In vivo og ex vivo, brainstems ble oppsamlet, fiksert, og skåret i seksjoner. Når seksjoner ble fremstilt, ble immunhistokjemisk deteksjon av c-Fos-proteinet laget for å identifisere de hjernestammen grupper av celler aktivert av hypoksiske eller Hyperkapni stimuleringer. Merkede celler ble tellet i hjernestammen respiratoriske strukturer. I forhold til kontroll tilstand, hypoksi eller hyperkapni økt antall c-fos merkede celler i flere spesifikke hjernestammen områder som er således konstitutiv av nervebaner som er involvert i tilpasning av den sentrale respirasjonen.

Introduction

Den c- fos genet ble identifisert for første gang i begynnelsen av 1980 ^1,2 og dens produktet ble preget i 1984 som en kjernefysisk protein som har genet-aktivator egenskaper ^3,4. Det deltar i langsiktige mekanismer forbundet med nervecelle stimulering. Faktisk, endringer i neuronal aktivitet føre til sekundære budbringersystemer signaleringskaskader som induserer ekspresjon av det umiddelbare tidlige gen c-fos, som induserer produksjonen av transkripsjonsfaktoren c-FOS. Sistnevnte starter uttrykk for sene gener og deltar dermed i tilpasninger i nervesystemet til mange forskjellige typer stimuli ^4. Således, siden slutten av 1980 ^5,6, c-Fos-proteinet detektering har blitt hyppig brukt for å studere virkningene av eksogene faktorer på gentranskripsjon generelt ⁴ og på aktivitet i sentralnervesystemet (CNS) for kartlegging av nervebaner involvert i forskjellige fysiologiskeal forhold.

Basal c-fos uttrykk har blitt undersøkt i ulike arter, inkludert mus, rotte, katt, ape og menneske ^fire. Derved kinetikken av dets ekspresjon er relativt godt kjent. Den transkripsjonsaktivering er hurtig (5 til 20 min), ^7,8, og mRNA akkumuleringen når et maksimum mellom 30 og 45 min etter starten av stimuleringen ⁹ og avtar med en kort halveringstid på 12 min. C-Fos proteinsyntese følger mRNA-akkumulering og kan bli detektert ved immunohistokjemi på 20 til 90 minutter etter stimulering ^6.

Analyse av c-fos ekspresjonen er klassisk anvendes i in vivo studier for å identifisere den sentrale luftnettet involvert i ventilasjons reaksjoner på hypoksi eller hyperkapni ^10-14. Flere nylig, dette verktøyet ble også brukt i ex vivo hjernestammen forberedelser for å utforske sentrale luftveisnettverks tilpasninger til hypoksi eller hypercapnia ^15-18. Faktisk disse preparatene generere en rytmisk aktivitet klassisk assimilert til den sentrale respirasjonen ^19. Således denne type preparat har fordelen av å være fullstendig deafferented, og resulterer derfor av c-fos ekspresjonen bare reflektere konsekvensene av en sentral stimulering uten innblanding av perifere strukturer.

C-Fos deteksjon kan bli tatt opp av immunohistokjemiske eller immunohistofluorescence tilnærminger. Indirekte immundeteksjon nødvendiggjør bruk av et primært antistoff mot c-fos og et sekundært antistoff rettet mot de artene i hvilke det primære antistoff ble produsert. For immunhistokjemisk fremgangsmåte blir det sekundære antistoff konjugert med et enzym (peroksydase, for eksempel) som virker på et substrat (H ₂ O ₂ for peroksidase). Produktet fra den enzymatiske reaksjon blir utviklet av et kromogen (3,3-diaminobenzidin tetrahydrochloride), som farger det, og kan iakttas i henhold til lysmikroskopi. Reaksjonen kan bli forsterket ved bruk av nikkel ammoniumsulfat. Disse fremgangsmåter tillater påvisning av aktive bestanddeler neuroner i løpet av forskjellige fysiologiske utfordringer og derfor identifikasjon og / eller kartlegging av perifere og sentrale trasé som er involvert i de på hverandre følgende fysiologiske responser.

Protocol

Merk: c-FOS påvisning er en standardisert prosedyre som involverer flere trinn (figur 1). Alle forsøkene ble utført på rotter eller mus. Eksperimentelle protokoller ble godkjent av etikkomiteen i dyreforsøk Charles Darwin (Ce5 / 2011/05), gjort i samsvar med europeiske fellesskap Rådsdirektiv av 22 september 2010 (2010/63 / EU) for dyr omsorg, og gjennomføres i samsvar med franske lover for dyr omsorg. 1. Utarbeidelse av Solutions Fremstille 0,2 M natriumfo…

Representative Results

C-FOS gjenkjenning er et nyttig verktøy som gjør det mulig å identifisere grupper av aktiverte celler under spesielle forhold som hypoksi og hyperkapni in vivo (figur 2A) eller i situasjoner som etterligner disse forholdene ex vivo (figur 2B). In vivo, nyfødt, unge eller voksen gnagere ble plassert i en lufttett boks i hvilken det gassformige omgivelsene blir kontinuerlig fornyes ved en gassblanding med en sammensetning nø…

Discussion

C-fos er en umiddelbar tidlig genet, og påvisningen av dets produkt, c-Fos-proteinet, er klassisk brukes til å identifisere neuronale populasjoner som er involvert i bestemte luftveisresponser in vivo ^11,13,25,28 og ex vivo ^{16-18, 27,32,33.}

Kritiske trinnene i protokollen

Vær forsiktig under perfusjon trinn. 4% PFA løsning må være godt forberedt og feste og post-fiksering sk…

Materials

Cell culture plate 12-Well	Costa	35/3
15 mm Netwell inserts with mesh polyester membrane	Corning	3477	The 15mm diameter well inserts have 74µm polyester mesh bottoms attached to polystyrene inserts
primary antibody (rabbit polyclonal antibody against the c-Fos protein)	Santa Cruz Biotechnology	sc-52
Vectastain Elite ABC KIT	Vector laboratories	PK-6101
(Rabbit IgG-secondary antibody)
NaH2PO4*2H2O	Sigma	71505
Na2HPO4	Sigma	S7907
Paraformaldehyde	Sigma	P6148
NaOH 0.1N	Sigma	43617
Polyvinyl-Pyrrolidone	Sigma	PVP-360
Sucrose	Sigma	S7903
NaCl	Sigma	S7653
Ethylene-glycol	Sigma	33068
Triton X100	Sigma	T8787
Trisma HCl	Sigma	T5941
Trisma Base	Sigma	T1503
3.3-diaminobenzidine tetrahydrochloride	Rockland	DAB50
Nickel ammonium sulphate	Alfa Aesar	12519
H2O2	Sigma	H1009
Xylene	Sigma	33817
Entellan Neo	Merck Millipore	107961
Slide	Thermo-scientific	1014356190	Superfrost ultraplus
Cover glass	Thermo-scientific	Q10143263NR1	24 x 60mm
BSA	Sigma	A2153