Peixe-zebra como um modelo para avaliar o potencial teratogênico de nitrito
Summary
A exposição a teratógenos podem causar defeitos de nascimento. Os peixes-zebra são úteis para a determinação do potencial teratogénico de produtos químicos. Nós demonstrar a utilidade de peixe-zebra, expondo embriões para vários teores de nitritos e também em diferentes tempos de exposição. Mostramos que os nitritos podem ser tóxicos e causar graves defeitos do desenvolvimento.
Abstract
Altos níveis de nitrato no ambiente pode resultar em defeitos congênitos ou abortos espontâneos em humanos. Presumivelmente, isto deve-se a conversão de nitrato em nitrito pelas bactérias intestinais e salivares. No entanto, em outros estudos de mamíferos, altos níveis de nitrito não causar defeitos de nascimento, embora possam levar a resultados reprodutivos pobres. Assim, o potencial teratogénico de nitrito não é clara. Seria útil dispor de um sistema de modelo animal vertebrado para avaliar facilmente efeitos teratogénicos de nitrito ou qualquer outro produto químico de interesse. Aqui, nós demonstrar a utilidade de peixe-zebra (Danio rerio) para rastrear compostos para toxicidade e defeitos embrionárias. embriões de peixe-zebra são fertilizados externamente e ter um desenvolvimento rápido, o que os torna um bom modelo para estudos teratogênicos. Nós mostramos que o aumento do tempo de exposição ao nitrito afecta negativamente a sobrevivência. O aumento da concentração de nitrito também afecta adversamente a sobrevivência, enquanto que o nitrato não. Para tha embriõest sobreviver à exposição nitrito, vários defeitos podem ocorrer, incluindo pericárdio e gema de edema sac, nadar noninflation bexiga, e malformação craniofacial. Os nossos resultados indicam que o peixe-zebra é um sistema conveniente para estudar o potencial teratogénico de nitrito. Esta abordagem pode ser facilmente adaptada para testar outros produtos químicos para os seus efeitos sobre o desenvolvimento dos vertebrados precoce.
Introduction
Teratogénese é um processo que interrompe o desenvolvimento normal de um embrião ou feto por determinação de alterações funcionais e estruturais permanentes, retardamento do crescimento, ou aborto em casos graves 1. Ela pode ser causada por certos agentes naturais (teratógenos), os quais interferem com o desenvolvimento embrionário de várias maneiras 2. Durante o desenvolvimento fetal humano, teratogens comum, tais como a radiação, agentes infecciosos, metais tóxicos e químicos orgânicos foram relatados para causar defeitos de dobras epicanthic (a dobra de pele na pálpebra superior) e clinodactilia (dedo curvo ou pés) através de erros morfogenéticos 1.
Compreender o mecanismo molecular de teratogenesis é o primeiro passo para o desenvolvimento de tratamento e prevenção. Vários modelos de vertebrados, tais como o sapo com garras Africano (Xenopus laevis) e peixe-zebra (Danio rerio) têm sido utilizados para determinar as vias moleculares afectadas por TeratOgens. Estudos anteriores têm usado peixe-zebra como um modelo para a epidemiologia, toxicologia e teratogenesis 3-7. Scholz et ai. considerada peixe-zebra como um "padrão ouro" para a avaliação da toxicidade ambiental. Isto é devido, em parte, para a transparência do embrião do peixe-zebra, o que permite aos investigadores visualizar o defeito de desenvolvimento, uma vez que ocorre 8. Aproximadamente 70% dos genes humanos ortólogos tem no peixe-zebra, fazendo com que um modelo de peixe-zebra vertebrado desejável para o estudo de defeitos humanos 9.
Alguns estudos epidemiológicos têm sugerido que o nitrato e nitrito, comumente presente em alimentos agrícolas e água, estão associados a defeitos de nascimento ou abortos espontâneos 10,11, enquanto outros estudos não suportam essa associação 12. Nitrato (NO3 -) e nitrito (NO 2 -) estão naturalmente presentes no solo e na água. Eles são uma fonte de nitrogênio para as plantas e são uma parte do nciclo itrogen 13. Alimentos como feijão verde, cenoura, abóbora, espinafre e beterraba de fazendas que usam fertilizantes ricos em nitrato de ter aumentado significativamente os níveis de nitrato e nitrito 7. Leite de vacas alimentadas com alimentos à base de nitrato altos e peixes em água de alta nitrato (principalmente de escoamento do solo 30) pode levar a seres humanos que consomem grandes quantidades de nitrato e nitrito 14. Nitratos e nitritos são também vulgarmente utilizados na conservação de alimentos, o que aumenta dramaticamente a quantidade ingerida pelo ser humano 12.
Níveis óptimos de nitrato e nitrito desempenham papéis fundamentais em processos fisiológicos como a homeostase vascular e função, neurotransmissão e mecanismos de defesa do hospedeiro imunológicos 13-15. No entanto, a exposição a altos níveis de nitrato e nitrito pode levar a efeitos adversos, especialmente em lactentes e crianças de 16. nitrato ingerido é ainda convertido em nitrito na cavidade oral e pela microflora no the trato gastrointestinal pela microflora intestinal 17.
Nitrato coloca crianças em um alto risco para a síndrome do bebê azul por oxidação da hemoglobina em metemoglobina, prejudicando a hemoglobina a partir do seu transporte de oxigénio capacidade 18. Isto resulta em que a cor azul da pele que se estende para os tecidos periféricos, em casos mais graves. Oxigenação inibido de tecidos resulta em outros sintomas, mais severamente levando a coma e morte 19,20. Sintomas semelhantes são observados em bebés e adultos em concentrações mais altas de nitrato de 21. Níveis elevados de metemoglobina em adultos devido a resultados de intoxicação de nitrito em cianose, dor de cabeça, distúrbios respiratórios 31, e morte se não for tratada devido a complicações relacionadas com a hipóxia tecidual vital 32,33.
Nitrato de ingerido em níveis mais elevados também pode resultar em várias complicações de saúde. diabetes infância, diarreia recorrente e infecções recorrentes do trato respiratórioem crianças têm sido relacionados com alta nitrato 11,17,22 ingestão. A exposição crônica a um elevado nível de nitrato está associado com a micção e hemorragia do baço. Exposição aguda a doses elevadas de nitratos pode levar a um largo espectro de condições médicas tais como dor abdominal, fraqueza muscular, sangue nas fezes e urina, desmaios, e da morte 11. A exposição pré-natal ao nitrato em níveis elevados tem sido associada a defeitos do tubo neural e músculo-esquelético 11.
Um relatório recente mostrou que o tratamento de embriões de peixe-zebra com nitrito levou a gema edema sac, malformações craniofaciais e axiais, e nadar bexiga noninflation 5. No presente estudo, nós demonstramos um método para o tratamento de embriões de peixes-zebra com nitrato e nitrito para determinar o seu potencial teratogénico. Os embriões foram expostos a nitrito em diferentes concentrações e em diferentes períodos de tempo. O etanol foi utilizado como um controlo positivo, uma vez que é um agente teratogénico estabelecido em 23. Our método mostraram que ambas as concentrações elevadas e longos tempos de exposição a nitrito eram prejudiciais à sobrevivência e resultou em vários fenótipos, variando de leve (edema) a graves defeitos de desenvolvimento (bruto). Portanto, o peixe-zebra é um modelo útil para explorar diretamente os potenciais efeitos teratogênicos de nitrato e nitrito em embriões para complementar os estudos epidemiológicos.
Protocol
Representative Results
Discussion
O método descrito aqui demonstra a utilidade do peixe-zebra na avaliação do potencial teratogênico de nitrito e nitrato. Em comparação com outros vertebrados, zebrafish têm vantagens que incluem alta fecundidade, fecundação externa, transparência óptica e rápido desenvolvimento. Os mutantes que carecem de pigmentação disponíveis (tais como o peixe-zebra) Casper 36 também ajudam a aumentar a visibilidade dos órgãos internos. Também é fácil de gerar peixes-zebra transgénicos com genes rep?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
VK was funded by grants from the IUP Department of Biology and School of Graduate Studies and Research (Graduate Student Professional Development). CQD and TWS were supported by the IUP School of Graduate Studies and Research (Faculty Publication Costs/Incidental Research Expenses). We also thank members of the Diep laboratory for maintaining the zebrafish facility.
Materials
| DREL/2010 instrument | Hach | 26700-03 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023 | |
| KIMAX glass Petri Dish | VWR | 89001-244 | |
| MS-222 | Sigma-Aldrich | E10521 | |
| NitraVer 5 Nitrate Reagent | Hach | 14034-46 | |
| NitriVer 3 Nitrite Reagent | Hach | 14065-99 | |
| Parafilm | Fisher Scientific | 3-374-10 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| S6E stereomicroscope | Leica | 10446294 | |
| Sodium nitrate | Fisher Scientific | S343 | |
| Sodium nitrite | Fisher Scientific | S347 | |
| Transfer pipets | Laboratory Products Sales | L320072 | |
| Glass vials | Fisher Scientific | 03-338B |
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