Zebravis als een model om de teratogene potentie van nitriet Assess

Summary

Blootstelling aan teratogens kan geboorteafwijkingen veroorzaken. Zebravis zijn nuttig voor het bepalen van het teratogeen potentieel van chemicaliën. We demonstreren het nut van zebravis embryo's door blootstelling aan verschillende niveaus van nitriet en ook op verschillende tijden van blootstelling. We tonen aan dat nitriet giftig zijn en ernstige ontwikkelingsstoornissen.

Abstract

Hoog nitraatgehalte in het milieu kan leiden tot aangeboren afwijkingen of miskramen bij de mens. Vermoedelijk komt dit door de omzetting van nitraat in nitriet door darm en speeksel bacteriën. Echter, in andere zoogdieren studies, hoge nitriet niveaus niet leiden tot aangeboren afwijkingen, maar ze kunnen leiden tot slechte reproductieve uitkomsten. Zo is het teratogeen potentieel van nitriet is niet duidelijk. Het zou nuttig zijn een vertebraat modelsysteem teratogene effecten van nitriet of andere chemische plaats gemakkelijk beoordeling te zijn. Hier tonen we het nut van de zebravis (Danio rerio) om verbindingen op toxiciteit en embryonale afwijkingen te screenen. Zebravis embryo's worden extern bevrucht en hebben een snelle ontwikkeling, waardoor ze een goed model voor teratogene studies. We tonen aan dat het verhogen van de tijd van blootstelling aan nitriet negatief beïnvloedt overleving. Verhogen van de concentratie van nitriet ook afbreuk overleven, terwijl nitraat niet. Voor embryo's that overleven nitriet blootstelling, kunnen diverse gebreken voordoen, met inbegrip pericardiale en dooierzak oedeem, zwemblaas noninflation en craniofaciale misvormingen. Onze resultaten geven aan dat de zebravis is handig voor het bestuderen van teratogene eigenschappen van nitriet. Deze benadering kan eenvoudig worden aangepast aan andere teststoffen op hun effecten op de vroege ontwikkeling van vertebraten.

Introduction

Teratogenese is een proces dat de normale ontwikkeling van een embryo of foetus verstoort door het veroorzaken van blijvende structurele en functionele abnormaliteiten, groeiachterstand, miskraam of in ernstige gevallen ^1. Het kan worden veroorzaakt door bepaalde natuurlijke middelen (teratogens), die interfereren met de embryonale ontwikkeling op verschillende manieren ^2. Tijdens de foetale ontwikkeling van de mens, hebben gemeenschappelijke teratogens zoals straling, infectieuze agentia, giftige metalen en organische chemicaliën gemeld om defecten in epicanthic plooien (de huidplooi in het bovenste ooglid) en clinodactyly (gekromde vinger of teen) door middel van morfogenetische fouten veroorzaken ^1.

Het begrijpen van de moleculaire mechanisme van teratogenese is de eerste stap naar de ontwikkeling van de behandeling en preventie. Verscheidene vertebrate modellen zoals de Afrikaanse klauwkikker (Xenopus laevis) en de zebravis (Danio rerio) zijn gebruikt om de moleculaire mechanismen die door terat bepalenOgens. Eerdere studies hebben zebravis als model voor de epidemiologie, toxicologie en teratogenese ^3-7. Scholz et al. beschouwd zebravis als een "gouden standaard" voor de beoordeling milieutoxiciteit. Dit is deels te wijten aan de transparantie van het zebravis embryo, waardoor onderzoekers de ontwikkelingsdefect voorstellen als het zich voordoet ^8. Ongeveer 70% van de menselijke genen orthologen in zebravis, waardoor zebravis een wenselijke vertebrate Modelmatige menselijke fouten ^9.

Sommige epidemiologische studies hebben gesuggereerd dat nitraat en nitriet, vaak in de boerderij voedingsmiddelen en water, worden geassocieerd met aangeboren afwijkingen of spontane abortus ^10,11, terwijl andere studies niet deze vereniging ¹² ondersteunen. Nitraat (NO _{³ -)} en nitriet (NO ₂ ^-) zijn van nature aanwezig in de bodem en het water. Ze zijn een stikstofbron voor planten en zijn een deel van de nitrogen cyclus ^13. Voedingsmiddelen zoals groene bonen, wortelen, squash, spinazie, en bieten uit bedrijven die meststoffen hoog in nitraat gebruiken aanzienlijk vergroot niveaus van nitraat en nitriet ^7. Melk van koeien gevoed met hoog nitraatgehalte voedingsmiddelen en vis in hoog nitraatgehalte water (vooral uit de bodem runoff ³⁰⁾ kan leiden tot de mens consumeren van grote hoeveelheden nitraat en nitriet ^14. Nitraat en nitriet worden ook vaak gebruikt in voedselbehoud dat de ingenomen door mensen ¹² hoeveelheid drastisch verhoogt.

Optimale niveaus van nitraat en nitriet speelt een fundamentele rol in fysiologische processen zoals de vasculaire homeostase en functie, neurotransmissie en immunologische afweer mechanismen ^13-15. Echter, kan de blootstelling aan hoge niveaus van nitraat en nitriet leiden tot nadelige effecten, vooral bij zuigelingen en kinderen ^16. Ingested nitraat verder omgezet in nitriet in de mondholte van microflora en in The maagdarmkanaal door darmflora ^17.

Nitraat zet baby op een hoog risico voor de Blauwe baby door oxidatie van hemoglobine tot methemoglobine, afbreuk hemoglobine uit de zuurstof-dragende vermogen ^18. Dit leidt tot de blauwe kleur van de huid die zich uitstrekt tot de perifere weefsels in meer ernstige gevallen. Remde zuurstofvoorziening van de weefsels resultaten in andere symptomen, zwaarst leiden tot coma en de dood ^19,20. Soortgelijke symptomen zijn waargenomen bij baby's en volwassenen bij hogere concentraties nitraat ^21. Verhoogde niveaus van methemoglobine bij volwassenen als gevolg van nitriet vergiftiging resultaten in cyanose, hoofdpijn, ademhalingsstoornissen ^31, en ​​de dood als deze niet behandeld als gevolg van complicaties in verband met vitale weefselhypoxie ^32,33.

Nitraat ingenomen op hogere niveaus kan ook leiden tot verschillende gezondheidsproblemen complicaties. Jeugd diabetes, terugkerende diarree en recidiverende luchtweginfectiesbij kinderen in verband gebracht met een hoge inname van nitraat ^11,17,22. Chronische blootstelling aan een hoog nitraatgehalte wordt geassocieerd met plassen en bloedingen milt. Acute blootstelling hoge dosis nitraten kan leiden tot een breed spectrum van medische aandoeningen zoals buikpijn, spierzwakte, bloed in de ontlasting en urine, flauwvallen en ¹¹ dood. Prenatale blootstelling aan nitraat op een hoog niveau is geassocieerd met neurale buis en musculoskeletale defect ^11.

Een recent rapport toonde aan dat de behandeling van de zebravis embryo's met nitriet leidde tot sac oedeem, craniofaciale en axiale misvormingen dooier, en zwemblaas noninflation ^5. In deze studie demonstreren we een werkwijze voor het behandelen zebravisembryo's met nitraat en nitriet hun teratogeen effect bepalen. Embryo's werden blootgesteld aan verschillende concentraties nitriet en verschillende tijdsduren. Ethanol werd gebruikt als een positieve controle, omdat het een gevestigde teratogeen ^23. Our methode toonde dat zowel hoge concentraties en lange blootstellingstijden aan nitriet waren nadelig voor overleving en resulteerde in verschillende fenotypes, variërend van licht (oedeem) tot ernstig (bruto ontwikkelingsdefecten). Daarom is de zebravis is een bruikbaar model voor het direct het verkennen van de mogelijke teratogene effecten van nitraat en nitriet op embryo's epidemiologische studies aan te vullen.

Protocol

De in dit protocol beschreven procedures werden goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite aan de Indiana University of Pennsylvania. 1. Harvest Embryo's Handhaaf zebravis bij 28,5 ° C, pH 7, geleidbaarheid tussen 500-1,500 microseconde en een licht / donker-cyclus van 14 uur licht en 10 uur donker 24. Gebruik wild-type stammen zoals Tu, AB of TU / AB hybride. Verschillende stammen kunnen anders reageren op chemische behandeling 25. …

Representative Results

Blootstelling aan 300 mM ethanol gedurende 22 uur had geen effect op de overleving (gegevens niet getoond), in overeenstemming met eerdere rapporten 5,23,26. Dit wordt verwacht, ethanol is een bekende teratogeen en diende als een positieve controle. Waargenomen fenotypes inbegrepen pericardiale oedeem, blaas noninflation swim (figuur 1), craniofaciale defecten, en ontwikkelingsachterstand (gegevens niet getoond). <p class="jove_content" fo:keep-together.wi…

Discussion

De hier beschreven methode toont de bruikbaarheid van zebravis bij de beoordeling van de teratogene potentie van nitriet en nitraat. Vergeleken met andere gewervelde dieren, zebravis hebben voordelen die hoge vruchtbaarheid, externe bevruchting, optische transparantheid en snelle ontwikkeling omvatten. Verkrijgbaar mutanten die pigmentatie missen (zoals de zebravis Casper ³⁶⁾ dragen eveneens bij aan de zichtbaarheid van de inwendige organen te verbeteren. Het is ook gemakkelijk om transgene zebravis met repor…

Materials

DREL/2010 instrument	Hach	26700-03
Ethanol	Sigma-Aldrich	E7023
KIMAX glass Petri Dish	VWR	89001-244
MS-222	Sigma-Aldrich	E10521
NitraVer 5 Nitrate Reagent	Hach	14034-46
NitriVer 3 Nitrite Reagent	Hach	14065-99
Parafilm	Fisher Scientific	3-374-10
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	158127
S6E stereomicroscope	Leica	10446294
Sodium nitrate	Fisher Scientific	S343
Sodium nitrite	Fisher Scientific	S347
Transfer pipets	Laboratory Products Sales	L320072
Glass vials	Fisher Scientific	03-338B