ここでは、プロトコルは、キネシン-1貨物を識別するために提示されています。キネシン-1重鎖(KIF5B)のモータレス変異体は、細胞質内で凝集し、その貨物の凝集を誘導します。両方の凝集体は、蛍光顕微鏡下で検出されます。同様の戦略は、他のモータータンパク質の貨物を識別するために使用することができます。
Fluorescence microscopy is employed to identify Kinesin-1 cargos. Recently, the heavy chain of Kinesin-1 (KIF5B) was shown to transport the nuclear transcription factor c-MYC for proteosomal degradation in the cytoplasm. The method described here involves the study of a motorless KIF5B mutant for fluorescence microscopy. The wild-type and motorless KIF5B proteins are tagged with the fluorescent protein tdTomato. The wild-type tdTomato-KIF5B appears homogenously in the cytoplasm, while the motorless tdTomato-KIF5B mutant forms aggregates in the cytoplasm. Aggregation of the motorless KIF5B mutant induces aggregation of its cargo c-MYC in the cytoplasm. Hence, this method provides a visual means to identify the cargos of Kinesin-1. A similar strategy can be utilized to identify cargos of other motor proteins.
キネシン-1は、その貨物1,2の順行性輸送を媒介するモータータンパク質です。これは、キネシン軽鎖1(KLC1)とキネシン重鎖の2つのサブユニット(KHCs)の二つのサブユニットのヘテロ四量体です。 KIF5B 1、KHCは、そのN末端 、ATPを加水分解し、微小管に沿った移動のための機械的エネルギーに化学エネルギーに変換するにモータードメインが含まれています。そのC末端領域は、貨物と関連付けるKLC1、と相互作用する二量体化ドメインが含まれています。キネシン-1は、小胞、細胞小器官およびmRNAを3,4として貨物を輸送します。最近、KIF5Bは細胞質5プロテオソーム分解の核転写因子のc-MYCを輸送することが示されました。三つの方法(化学的阻害剤は、siRNA / shRNAのドミナントネガティブ変異体)は、キネシン-1機能を阻害するために使用されました。彼らはすべての細胞質中でのc-MYCの凝集を誘導しました。最後の方法論では、c-MYCのみが支配的negatの影響を受けましたアイブKIF5Bの変異体ではなく、別の関連KIF5Aモータータンパク質のそれによって、変異体は、(微小管破壊など)の細胞内成分上またはタンパク質凝集の一般的な影響を及ぼさないことを示唆しています。 KIF5Bのドミナントネガティブ変異体はまた、転写因子の一般的な効果を発揮しないことを示唆している、他の転写因子に影響を及ぼしませんでした。むしろ、それは、ドミナントネガティブ変異体は、その貨物の特定の効果を発揮することを示唆しています。
ドミナントネガティブ変異体の使用は、モータータンパク質の分野では一般的です。キネシンとミオシンの類似モータレス変異体は、以前に使用されました。これらは主に貨物の細胞内局在にまたは6-12細胞機能の変異体の効果を実証するために使用されました。あまり重点が変異体およびそれらによって影響を受けた貨物の間の空間的関係に置かれました。しかし、いくつかの発生率では、変異体は、そのCAと共局在することが観察されましたrgos 6,10。
KIF5Bおよびその関連タンパク質との間の相互作用は、以前のインビボ酵母ツーハイブリッドアッセイなどの共免疫沈降およびインビトロプルダウンアッセイ13-16 における生化学的プルダウンアッセイにより確認されました。この記事では、蛍光顕微鏡を使用して追加の視覚的方法は、KIF5B貨物タンパク質を同定するために記載されています。この方法は、ドミナントネガティブ変異体として機能するモータレスKIF5B変異体を使用しています。これは、細胞質内で凝集し、その貨物の凝集を誘導します。
17 tdTomato蛍光タンパク質と野生型およびモータレスKIF5B変異体のタグ付けは、蛍光顕微鏡によって、その可視化を可能にします。タグ付けされたKIF5Bタンパク質は、適切にKIF5Bタグから分離されたスペクトル特性を有する異なる蛍光タンパク質に融合された候補タンパク質と共発現させることができます。タグ付けされたタンパク質は、生きた細胞内で直接観察されます蛍光顕微鏡下で。モータレスKIF5B変異によって候補タンパク質の凝集の誘導は、候補タンパク質がKIF5B の in vivoでの貨物であることを確認します。また、tdTomatoタグKIF5Bタンパク質は、内因性の積荷タンパク質に対するそれらの効果を研究するために細胞内で単独で発現させることができます。その後、免疫蛍光顕微鏡は、蛍光色素と結合し、適切な二次抗体、続いて、トランスフェクトした細胞を固定し、内因性候補タンパク質に対して特異的な抗体で染色された中で行われます。この場合には、その生理的なレベルで内因性の候補タンパク質が検討されています。他のモータータンパク質の類似モータレス変異体は、その貨物を識別するために調製することができます。
記載の方法は、微小管に沿って移動する能力を欠くモータレスKIF5B変異体の特性を利用するが、野生型KIF5Bと二量体を形成し、それによって、四量体タンパク質は、同一の積荷タンパク質と相互作用することを可能にする能力を保持します野生型KIF5Bなど。モータレスKIF5Bは、したがって、その貨物に集約しmislocalizedドミナントネガティブ変異体やフォームとして機能します。この方法は、キネシン-1貨物のc-myc( 図1)5 を識別するために実証されています。この記事では、同一のモータレスKIF5B変異体は、キネシン-1の別の潜在的なカーゴ( 図2)としてのp53を同定しました。これは、方法は、キネシン-1の他の貨物を識別することが可能であることを示しています。さらに、変異体の特異性は、陰性対照タンパク質のc-Fosの( 図3)上の変異の効果の欠如によって提供されます。
このプロトコルでは、tdTomatoタグ付き野生TYPEまたはモータレスKIF5Bタンパク質は、他の蛍光タンパク質タグ付き候補貨物のタンパク質と同時発現されます。この場合、生細胞の蛍光顕微鏡および画像化が行われます。凝集体の形成は、タイムラプスイメージングにより追跡することができます。あるいは、tdTomatoタグ付きタンパク質を単独で発現され、その生理学的なレベルで、候補貨物タンパク質は特異的抗体を用いた間接免疫蛍光顕微鏡法によって可視化されます。蛍光タンパク質tdTomatoは、その明るさと光安定17のために選択されます。背景は完全DMEM培地の自己蛍光に起因する高い場合、フェノールレッドを含まない培地を使用します。
モータレスKIF5B変異体は、化学量論的に野生型KIF5Bと二量体を形成します。したがって、その機能を阻害するために、野生型対応物との二量体を形成し、凝集体を形成するモータレスKIF5B変異体の十分な量を発現することが重要です。 、exprの最適化をこの問題に対処するために、モータレス変異体のessionが不可欠です。これは、二量体化ドメインを含む小さなモータレス変異体を使用することによって達成されます。さらに、適切なトランスフェクション試薬とプロトコルの最適化も必要です。 DNA /トランスフェクション試薬でHeLa細胞のインキュベーションの持続時間は、外因性タンパク質の発現および細胞生存率を、HeLa細胞中で最適化しました。インキュベーション期間は、他の細胞株のために最適化されなければなりません。
40Xへ4X間の倍率については、何のカバーガラスは必要ありません。細胞を直接ウェルに調べることができます。したがって、この場合には、プロトコルは、安価で便利です。 40X上記倍率のために、細胞を染色した後、油浸対物レンズ下の検査のために顕微鏡スライド上にマウントされ、ウェル中のカバーガラス上で増殖させています。
モータレスKIF5Bタンパク質の凝集の観察は、細胞質のサイズによって制限されます。検出が容易です多くの哺乳動物細胞中での集合体。しかし、細胞質の容積が核周囲および神経突起における小さい場合に神経細胞内凝集体を観察することは比較的困難です。
プロトコルは 、インビボ酵母ツーハイブリッドおよび生化学的プルダウンアッセイ13-16に加えKIF5Bと貨物との間の関連を示すために使用されます。すべてのこれらのアッセイは、異なる物理的条件下での関連性を決定し、それらの結果は、お互いを補完することができます。また、他のアッセイに対するこの蛍光アッセイの利点は、KIF5Bによって貨物の細胞内局在化( 図1及び2)の調節を示すことができることです。
プロトコルは、KIF5Bに限定されるものではなく、そのような他のいくつかのキネシンモーター3と貨物3の細胞内輸送に使用されるミオシンモーター23,24の一部として、他のモータータンパク質の貨物を識別するために使用することができます。これらのモータータンパク質はまた、オリゴマー化のためのキネシンモーターとミオシンモーター用マイクロフィラメント、およびコイルドコイルセグメントのための微小管に沿って移動用モータドメインを含みます。それらのほとんどは、ホモ二量体3,23を形成します 。したがって、同様の戦略は、その貨物を識別するために、それらのモータレスドミナントネガティブ変異体を作成することによって、それらを適用することができます。
The authors have nothing to disclose.
Roche’s Publication Grant covered the Free Access publication and production of this article. The author also thanks E. Premkumar Reddy, Richard V. Mettus, Stephen C. Cosenza, Sau Ying Yip and Sol D. Gloria for their support and critical reading of the manuscript.
absolute ethanol (200 proof) | Fisher Scientific | BP2818 | |
DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | |
Hoechst 33342 | Sigma-Aldrich | B2261 | |
Opti-MEM-I (transfection medium) | Life Technologies | 51985 | |
ProLong Diamond Antifade Mountant | Life Technologies | P36961 | |
formaldehyde, para | Fisher Scientific | O4042-500 | |
Triton-X100 | Fisher Scientific | BP337-500 | |
X-tremeGENE 9 DNA Transfection Reagent | Roche | 6365787001 | |
Taq DNA polymerase | Life Technologies | 10342020 | |
PCR Grade Nucleotide Mix (dNTP Mix) | Roche | 12111424 | |
Microscope cover glass | Fisher Scientific | 12-541A | |
GeneRuler 1 kb Plus DNA ladder | Life Technologies | SM1333 | |
PureLink Quick Gel Extraction kit | Life Technologies | K210012 | |
BamHI | New England Biolab | R0136 | |
SalI | New England Biolab | R0138 | |
T4 DNA ligase | New England Biolab | M0202T | |
Ethidium bromide | Thermo Scientific | 17898 | |
DMEM | Life Technologies | 11995-065 | |
c-MYC rabbit antibody | Cell Signaling | 5606 | |
p53 mouse antibody | Santa Cruz | sc-126 | |
Alexa Fluor 488-conjugated anti-rabbit IgG antibody | Life Technologies | A11008 | |
Alexa Fluor 488-conjugated anti-mouse IgG antibody | Life Technologies | A11059 | |
fluorescent microscope | Olympus IX71_Fluoview | ||
computer software for imaging | cellSens |