Här, är ett protokoll som presenteras för att identifiera Kinesin-1 last. En Motorfritt mutant av Kinesin-1 tung kedja (KIF5B) aggregat i cytoplasman och inducerar aggregation av dess last. Båda aggregaten upptäcks i fluorescensmikroskopi. En liknande strategi kan användas för att identifiera last av andra motorproteiner.
Fluorescence microscopy is employed to identify Kinesin-1 cargos. Recently, the heavy chain of Kinesin-1 (KIF5B) was shown to transport the nuclear transcription factor c-MYC for proteosomal degradation in the cytoplasm. The method described here involves the study of a motorless KIF5B mutant for fluorescence microscopy. The wild-type and motorless KIF5B proteins are tagged with the fluorescent protein tdTomato. The wild-type tdTomato-KIF5B appears homogenously in the cytoplasm, while the motorless tdTomato-KIF5B mutant forms aggregates in the cytoplasm. Aggregation of the motorless KIF5B mutant induces aggregation of its cargo c-MYC in the cytoplasm. Hence, this method provides a visual means to identify the cargos of Kinesin-1. A similar strategy can be utilized to identify cargos of other motor proteins.
Kinesin-1 är en motor protein som medierar anterograd transport av dess last 1,2. Det är en heterotetramer av de två underenheterna av Kinesin lätt kedja 1 (KLC1) och två subenheter av Kinesin tunga kedjor (KHCs). KIF5B 1, en KHC, innehåller en motor domän vid sin N-terminal, som hydrolyserar ATP och omvandlar den kemiska energin till mekanisk energi för rörelse längs mikrotubuli. Dess C-terminala region innehåller dimeriseringsdomän som interagerar med KLC1, som associerar med last. Kinesin-1 transporterar laster såsom vesiklar, organeller och mRNA 3,4. Nyligen var KIF5B visat att transportera kärntranskriptionsfaktorn c-MYC för proteosomal nedbrytning i cytoplasman 5. Tre metoder (kemisk inhibitor, siRNA / shRNA och dominant negativ mutant) användes för att inhibera Kinesin-1-funktionen. De alla inducerad aggregation av c-MYC i cytoplasman. För den sista metoden, var c-MYC endast påverkas av det dominerande negative mutant av KIF5B, men inte av den hos en annan relaterad KIF5A motorprotein, vilket tyder på att mutanten inte utövar allmänna effekter på de intracellulära komponenterna (såsom mikrotubuli störningar) eller på proteinaggregation. Den dominant negativ mutant av KIF5B inte heller påverka en annan transkriptionsfaktor, vilket tyder på att den inte utövar allmänna effekter på transkriptionsfaktorer. Snarare antyder det att den dominerande negativa mutanten utövar specifika effekter på dess last.
Användning av dominanta negativa mutanter är vanligt inom området för motorproteiner. Liknande Motorfritt mutanter av kinesiner och myosiner användes tidigare. De används främst för att visa effekterna av mutanterna på subcellulära lokaliseringar av deras last eller på cellulära funktioner 6-12. Mindre vikt lades på det rumsliga förhållandet mellan mutanterna och de laster som påverkas av dem. Men i vissa förekomster ades de mutanter observer att co-lokalisera med sina cargos 6,10.
Samspelet mellan KIF5B och dess associerade proteiner har tidigare bekräftats genom in vivo jäst två-hybridanalys och biokemiska rullgardins analyser såsom co-immunoprecipitation och i rullgardins vitro 13-16. I den här artikeln, är ytterligare en visuell metod som använder fluorescensmikroskopi beskrivs att identifiera KIF5B last proteiner. Metoden använder sig av en Motorfritt KIF5B mutant som fungerar som en dominant negativ mutant. Det aggregat i cytoplasman och inducerar aggregation av dess last.
Märkning av vildtyp och Motorfritt KIF5B mutant med det fluorescerande proteinet tdTomato 17 möjliggör deras visualisering med fluorescensmikroskopi. De taggade KIF5B proteinerna kan samuttryckas med en kandidatprotein sammansmält med en annan fluorescerande protein med spektralegenskaper separeras lämpligen från KIF5B taggen. De taggade proteinerna observeras direkt i levande cellerenligt fluorescensmikroskopi. Induktion av aggregering av kandidat protein genom Motorfritt KIF5B mutanten bekräftar att kandidatprotein är ett in vivo last av KIF5B. Vidare kan tdTomato-märkta KIF5B proteiner uttryckas ensam i cellerna för att studera effekterna på endogena last proteiner. Senare, är immunofluorescensmikroskopi genomföres i vilka de transfekterade cellerna fixeras och färgas med en specifik antikropp mot det endogena kandidatprotein, följt av en lämplig sekundär antikropp konjugerad med ett fluorescerande färgämne. I detta fall, studeras den endogena kandidatprotein på dess fysiologiska nivå. Liknande Motorfritt mutanter av andra motorproteiner kan vara beredd att identifiera sina laster.
Den metod som beskrivs utnyttjar egenskaperna hos den Motorfritt KIF5B mutanten, som saknar förmågan att röra sig längs de mikrotubuli, men bibehåller förmågan att bilda dimerer med vildtyp KIF5B och därigenom tillåta det tetramera proteinet att interagera med samma lastproteiner som vildtypen KIF5B. Motorfritt KIF5B därför verkar som en dominant negativ mutant och former mislocalized aggregat med dess last. Denna metod har visat sig identifiera Kinesin-en last c-MYC (figur 1) 5. I den här artikeln har samma Motorfritt KIF5B mutant som används för att identifiera p53 som en annan potentiell last av Kinesin-1 (Figur 2). Detta visar att den metod som är möjligt att identifiera andra laster av Kinesin-1. Vidare är specificiteten hos mutanten tillhandahålls av avsaknad av effekt av mutanten på det negativa kontrollproteinet c-Fos (Figur 3).
I detta protokoll, tdTomato-märkta vild tyPE eller Motorfritt KIF5B proteinet samuttrycks med ett annat fluorescerande protein-taggade last kandidatprotein. I detta fall är live-cell fluorescensmikroskopi och bildbehandling utförs. Bildningen av aggregat kan spåras genom time-lapse avbildning. Alternativt är den tdTomato-taggat protein som uttrycks ensamma och kandidaten last proteinet vid dess fysiologiska nivåer visualiseras genom indirekt immunofluorescens-mikroskopi med användning av specifika antikroppar. Det fluorescerande proteinet tdTomato väljs för dess ljusstyrka och fotostabilitet 17. Om bakgrunden är hög på grund av auto-fluorescens av fullständigt DMEM medium, medium utan fenolrött används.
Den Motorfritt KIF5B mutanten bildar dimerer med vildtyp KIF5B stökiometriskt. Därför är det viktigt att uttrycka tillräcklig mängd Motorfritt KIF5B mutant för att bilda dimerer med vildtyp motsvarighet att hämma dess funktion och att bilda aggregat. För att lösa detta problem, optimering av expression av Motorfritt mutanten är viktigt. Det uppnås genom att använda en liten Motorfritt mutant innehållande dimeriseringsdomän. Dessutom är det också nödvändigt optimering av den lämpliga transfektionsreagens och protokoll. Varaktigheten av inkubation av HeLa-celler med DNA / transfektionsreagens optimerades i HeLa-celler för expression av exogena proteiner och cellviabilitet. Inkubationen varaktighet kan behöva optimeras för andra cellinjer.
För förstoringar mellan 4X till 40X, inga täckglas krävs. Celler kan direkt undersökas i brunnarna. Därför, i detta fall, är det protokoll som billigt och bekvämt. För förstoringar över 40X celler odlas på täckglas i brunnarna och efter färgning, är monterade på objektglas för undersökning under oljeimmersions mål.
Observation av aggregat av Motorfritt KIF5B proteinet begränsas av storleken av cytoplasman. Det är lätt att detekteraaggregat i många däggdjursceller. Det är dock relativt svårt att observera aggregaten i neuronala celler när volymen av cytoplasman är liten runt kärnan och i neuriter.
Protokollet används för att visa sambandet mellan KIF5B och dess last utöver den in vivo jäst två-hybrid och biokemiska pull-down-analyser 13-16. Alla dessa analyser bestämma föreningen under olika fysiska förutsättningar och deras resultat kan komplettera varandra. Dessutom är fördelen med denna fluorescensanalys under andra analyser att det kan visa regleringen av subcellulära lokalisering av de laster genom KIF5B (figurerna 1 och 2).
Protokollet är inte begränsad till KIF5B och kan användas för att identifiera last av andra motorproteiner, såsom vissa andra kinesin motorer 3 och en del av de myosin motorerna 23,24 används i intracellulär transport av last 3. Dessa motorproteiner innehåller även motor domäner för rörelse längs mikrotubuli för kinesin motorer och microfilaments för myosin motorer och coiled-coil segment för oligomerisering. De flesta av dem bilda homodimerer 3,23. Därför kan en liknande strategi tillämpas på dem genom att skapa sina Motorfritt dominanta negativa mutanter för att identifiera sin last.
The authors have nothing to disclose.
Roche’s Publication Grant covered the Free Access publication and production of this article. The author also thanks E. Premkumar Reddy, Richard V. Mettus, Stephen C. Cosenza, Sau Ying Yip and Sol D. Gloria for their support and critical reading of the manuscript.
absolute ethanol (200 proof) | Fisher Scientific | BP2818 | |
DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | |
Hoechst 33342 | Sigma-Aldrich | B2261 | |
Opti-MEM-I (transfection medium) | Life Technologies | 51985 | |
ProLong Diamond Antifade Mountant | Life Technologies | P36961 | |
formaldehyde, para | Fisher Scientific | O4042-500 | |
Triton-X100 | Fisher Scientific | BP337-500 | |
X-tremeGENE 9 DNA Transfection Reagent | Roche | 6365787001 | |
Taq DNA polymerase | Life Technologies | 10342020 | |
PCR Grade Nucleotide Mix (dNTP Mix) | Roche | 12111424 | |
Microscope cover glass | Fisher Scientific | 12-541A | |
GeneRuler 1 kb Plus DNA ladder | Life Technologies | SM1333 | |
PureLink Quick Gel Extraction kit | Life Technologies | K210012 | |
BamHI | New England Biolab | R0136 | |
SalI | New England Biolab | R0138 | |
T4 DNA ligase | New England Biolab | M0202T | |
Ethidium bromide | Thermo Scientific | 17898 | |
DMEM | Life Technologies | 11995-065 | |
c-MYC rabbit antibody | Cell Signaling | 5606 | |
p53 mouse antibody | Santa Cruz | sc-126 | |
Alexa Fluor 488-conjugated anti-rabbit IgG antibody | Life Technologies | A11008 | |
Alexa Fluor 488-conjugated anti-mouse IgG antibody | Life Technologies | A11059 | |
fluorescent microscope | Olympus IX71_Fluoview | ||
computer software for imaging | cellSens |