Förbättra 2D och 3D Skin<em> In Vitro</em> Modeller Använda Macro Trängsel
Summary
Vi presenterar ett protokoll för att erhålla cell härledda matriser rik på extracellulära matrixproteiner, med hjälp av makromolekylära Crowders (MMC). Dessutom presenterar vi ett protokoll som omfattar MMC i 3D organotypic hud co-kultur generation, vilket minskar kultur tid med bibehållen löptid konstruktion.
Abstract
Glykoproteinet familjen gener representerar de viktigaste strukturella proteiner i människokroppen, och är viktiga komponenter i biomaterial som används i moderna vävnadsteknik. En teknisk flaskhals är avsättningen av kollagen in vitro, eftersom det är notoriskt långsam, vilket resulterar i suboptimal bildandet av bindväv och efterföljande vävnads sammanhållning, särskilt i hud modeller. Här beskriver vi en metod som innebär tillsättning av differentiellt stora sackaros sampolymerer till hud- kulturer för att generera makromolekylära utträngning (MMC), vilket resulterar i en dramatisk förbättring av kollagendeponering. Särskilt hudfibroblaster deponerat en betydande mängd av kollagen I / IV / VII och fibronektin i MMC i jämförelse med kontroller.
Protokollet beskriver också en metod för att decellularize trångt cellager, utsätta betydande mängder extracellulärt matrix (ECM) som kvarhölls på odlingsytan, vilket framgår av immunocytochemistry. Totalt matrismassa och distributionsmönster studerades med hjälp av störnings eftertanke mikroskopi. Intressant, fibroblaster, keratinocyter och co-kulturer framställda cell härledda matriser (CDM) av varierande sammansättning och morfologi. CDM skulle kunna användas som "bio-ställningar" för sekundär cellsådd, där den nuvarande användningen av beläggningar eller ställningar, typiskt från xenogena djurkällor, kan undvikas, vilket rör sig mot mer kliniskt relevant applikationer.
Dessutom har denna protokoll beskriver tillämpningen av MMC under den nedsänkta fasen av en 3D-organotypic hud sam-odlingsmodell som var tillräcklig för att förstärka ECM nedfall i dermo-epidermala förbindelsen (DEJ), i synnerhet kollagen VII, huvudkomponenten förankrings fibriller. Elektronmikroskopi bekräftade förekomsten av förankrings fibriller i kulturer utvecklas med MMC, jämfört med kontroller. Detta är betydelsefullt eftersom förankrings fibriller tjudra dermis till epidermis därmedsom har en förformad mogen DEJ kan gynna hudtransplantat mottagare i termer av transplantat stabilitet och allmänt sårläkning. Vidare odlingstiden kondenseras från 5 veckor till 3 veckor för att erhålla en mogen konstruktion, vid användning av MMC, minska kostnaderna.
Introduction
Huden bildar en skyddande barriär genom att förhindra vattenförlust och patogen inträde. Det består av tre huvudkomponenter; de stromala rika dermis 1, en skiktad epidermis 2,3,4 ovanpå det, och dermo-epidermal junction mellan 5,6. Dermis består till stor del av kollagen och elastiska fibrer och är glest befolkat med fibroblaster 7. Däremot är cellrika epidermis består av flera lager av keratinocyter. Keratinocyterna i den innersta lagret är proliferativ och ge nya basalceller som förnyar och ersätter terminalt differentierande keratinocyter som ständigt flyttar till det yttre rsta lagret av huden och har förlorat sina kärnor och cytoplasma material, vilket resulterar i en hornlager som genomgår deskvamation.
Den dermala-epidermala förbindelsen, en specifik typ av basalmembran, är en komplex struktur som består av sammankopplade matrismolekyler, vilka tetheRS epidermis till dermis. Kollagen I-fibrer i dermis vävs med kollagen VII förankrings fibriller som är förankrade till kollagen IV rika lamina densa. Förankringsfilament (laminin 5, kollagen XVII och integriner) i sin tur ansluta lamina densa med hemidesmosomer av basala keratinocyter. Basala keratinocyter (stratum basale) har kapacitet att proliferera och förnya, samt differentiera och stratify att bilda de suprabasala skikten; stratum spinosum, stratum granulosum, och slutligen stratum corneum, som utgör kontaktytan av huden med miljön. På resa från det basala skiktet till det kornifierade lagret, keratinocyter växla uttrycksmönster av cytokeratiner och slutligen genomgår apoptos och inlägga sig i förhornade kuvert, skrov av specifika proteiner som är kovalent tvärbundna genom transglutaminasaktivitet.
Återskapa hud och dess skikt in vitro, inklusive de komplexa strukturer av dermal-epidermal korsning och huden extracellulära matrisen och att emulera cornification processen har länge fascinerat forskare och bioengineers som en utmanande uppgift. Det har skett betydande framsteg i hudens vävnadsteknik, till exempel, en framgångsrik utvinning av hudceller från patientens biopsier och generering av huden organotypic kulturer med hjälp av patientgenererade hudceller 8. Men fortfarande olösta problem som hänför sig till dålig utsöndring av extracellulära matrixproteiner av hudceller själva och resulterar i suboptimala hud modeller. Dessutom den tid som krävs för att generera 3D organotypic hud co-kultur med dagens protokoll varierar mellan fyra till åtta veckor, en tidsram som potentiellt skulle kunna förkortas med införlivandet av makromolekylära Crowders. Minska odlingstiden sparar reagenskostnader, minskar förekomsten av cellåldrande och minskar väntetiden för patienten ska produkten användas i kliniken.
t "> Makromolekylär utträngning (MMC) består i att införa specifika makromolekyler till odlingsmediet för att generera uteslutna volymeffekter. Dessa påverkar enzymatiska reaktionshastigheterna inklusive den proteolytiska klyvningen av prokollagen som är tardy under standard vattenhaltiga odlingsbetingelser 9-13. Under MMC, enzymatiska reaktioner är påskyndas utan att öka mängden av reagens 14,15 resulterar i, i fallet med prokollagen klyvning, en ökad mängd av kollagen i-molekyler i trånga kulturer jämfört med uncrowded kontroller 10. eftersom omvandlingen av prokollagen till kollagen medger bildning av kollagen heter, fibroblaster odlade med MMC under 48 timmar gav betydligt mer kollagen i jämfört med uncrowded fibroblastkulturer övervakas i upp till fyra veckor 11,16,17. Förutom effekter på enzymatiska aktiviteter som påverkar bildandet, stabilisering och ombyggnad av ECM, MMC också har visat sig direkt öka och modulera kollagenfiberbildning 18,19.Vi presenterar här en metod för att öka den extracellulära matrisen (ECM) produktion genom hudceller, i synnerhet, dermala fibroblaster och epidermala keratinocyter. Dessutom visar vi att den anrikade ECM producerad under MMC i monolagerkulturer kan decellulariseras och användas som rena cellhärledda matris (CDM).
Vi använder ett icke-konventionella sättet att visualisera och fullo uppskatta ECM deponerats av hudceller odlade med MMC. Interferensreflektions mikroskopi används typiskt för att studera cell-matrix-interaktioner eller cell-till-glas kontaktpunkter. Denna teknik användes i vårt system för att visa den totala mängden av matris avsattes på glasytan. Störningar reflektion mikroskopi i kombination med fluorescerande immunfärgning att få så mycket information i form av extracellulära matriskomposition och mönster, i närvaro och frånvaro av MMC.
Organotypic huden samkulturer är en klassisk metod för att modellera huden in vitro i ett tredimensionellt sammanhang. Medan tvådimensionella co-kulturer kan ge viktig information, är den begränsad vid omräkning dessa data och tillämpa den tillbaka till en in vivo miljö, som till sin natur är en tredimensionell struktur. Hudkeratinocyter, i synnerhet, är polariserade och innehåller apikala och basala segment som är nödvändiga för homeostas och cellvidhäftning. Dessutom är ett uttryck för typiska suprabasala proteiner i keratinocyter ovanför basalskiktet, såsom keratin 1, keratin 10 och filaggrin endast förekommer i samband med stratifiering och terminal differentiering av keratinocyter. Som terminal differentiering är knappast förekommer i typiska monoskiktsodlingar, är suprabasala proteinuttryck normalt inte uppnås i detta odlingssystem. Därför börjar organotypic kulturer nedsänkt i odlingsmedium, men är därefter lyfts till en luft-vätske-gränssnittet för att driva keratinocyte differentiering. Detta resulterar i expressionen av skiktnings markörer, även cornification och en generellt bättre återspegling av epidermal fysiologi. Medan andra grupper har tidigare genererat organotypic hud co-kulturer framgångsrikt har inrättandet av en funktionell dermo-epidermal korsning zon varit ett problem. Här presenterar vi en ny metod för att odla organotypic hud co-kulturer med en förbättrad basalmembran, i en kondenserad tidsram och utan att äventyra mognad av dessa konstruktioner. Detta skulle ge huden härmare för undersökning in vitro modellering, studiet av huden biologi och ett sortiment av screeningsanalyser.
Protocol
Representative Results
Discussion
Enhanced extracellular matrix is obtained upon introduction of macromolecular crowders to cell culture, owing to the excluded volume effect which increases the propeptide cleavage by proteinases. This results in extracellular matrix, in particular collagen, to be processed faster and deposited on the culture surface. While other groups have obtained thick fibroblast cell layers, it involved a culture time of several weeks20. In contrast, MMC described in this Protocol, dramatically shortens the culture time wh…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the Biomedical Research Council, Singapore through core support to the Institute of Medical Biology and grant SPF2013/005. M.R. was supported by a NUS Faculty Research Committee Grant (Engineering in Medicine) (M.R.) R-397-000-081-112, and the NUS Tissue Engineering Program (NUSTEP). The authors would like to thank Professor Irene Leigh for providing the collagen VII antibody. Electron microscopy work was carried out at the National University of Singapore Electron Microscopy Unit.
Materials
| Ascorbic acid | Wako | 013-12061 | Cell culture media additive |
| Cell culture inserts (6-well format) | Greiner Bio-One | 657610 | Organotypic cultures |
| Citrate solution | Dako | S2369 | DakoCytomation Target Retrieval Solution Citrate, pH 6 (x10) |
| Collagen (rat tail) | Corning | 354236 | Organotypic cultures |
| CnT-57 | CELLnTEC | CnT-57 | Cell culture media |
| DAB Substrate + chromogen kit | Dako | K3468 | Histology |
| Deep-well plate (6-well format) | Corning | 355467 | Organotypic cultures |
| ECL detection reagent | GE Healthcare Life Sciences | RPN2106 | Amersham ECL Western Blotting Detection Reagent |
| Electron microscope (TEM) | JEOL | JEM-1010 (100kV) | Transmission electron microscopy |
| Fibroblast media (FM) | High Glucose-DMEM + 10% Fetal Bovine Serum + 1% Penicillin Streptomycin | ||
| Ficoll PM70 | GE Healthcare Life Sciences | 17-0310-05 | Macromolecular crowder |
| Ficoll PM400 | GE Healthcare Life Sciences | 17-0300-05 | Macromolecular crowder |
| Keratinocyte serum-free media (KSFM) | Life Technologies | 17005-042 | Cell culture media |
| Lysis buffer | ThermoFisher Scientific | 89900 | Lysis buffer for protein extraction. A protease inhibitor (Roche, #11836170001) was added to this lysis buffer. |
| Microscope | Zeiss | LSM510 | Red, green and blue channels to visualize AF594, AF488 and DAPI fluorescent immunostainings (40X mag). |
| Mounting media (Hydromount) | National Diagnostics | HS-106 | Fluorescent staining |
| Mounting media (Cytoseal) | ThermoFisher Scientific | 8310-16 | Histology (HRP) |
| OCT compound (Tissue Tek) | Sakura | 4583 | Embedding for cryotomy |
| Penicillin-streptomycin antibiotics | Sigma Aldrich | A5955 | Cell culture media additive |
| Primary antibodies | |||
| Anti-Collagen I antibody | Abcam | #ab6308 | |
| Anti-Collagen Type IV | Novocastra | #NCL-COLL-IV | |
| Anti-collagen VII | LH7.2 (in house) | ||
| Anti-Fibronectin antibody | Abcam | #ab2413 | |
| Reducing agent | ThermoFisher Scientific | NP0009 | Western blot |
| Sample buffer | ThermoFisher Scientific | NP0008 | Western blot |
| Secondary antibodies (Immunostaining) | |||
| 4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI) | Sigma Aldrich | #D9542 | |
| AlexaFluor 594 goat-anti-rabbit | ThermoFisher Scientific | #A-11037 | |
| AlexaFluor 594 goat-anti-mouse | ThermoFisher Scientific | #A-11005 | |
| AlexaFluor 488 chicken-anti-rabbit | ThermoFisher Scientific | #A-21441 | |
| AlexaFluor 488 goat-anti-mouse | ThermoFisher Scientific | #A-11001 | |
| Secondary antibodies (HRP) | Dako | Envision + System – HRP Labelled Polymer Anti-Rabbit and Anti-Mouse | undiluted |
| Sodium deoxycholate | Prodotti Chimicie Alimentari | Decellularization | |
| Stratification media | |||
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium | Used during the air-liquid interface of organotypic cultures. This media is added to the outside of the cell-culture insert. | ||
| Ham’s F12 | Used during the air-liquid interface of organotypic cultures. This media is added to the outside of the cell-culture insert. | ||
| 10% fetal bovine serum | Used during the air-liquid interface of organotypic cultures. This media is added to the outside of the cell-culture insert. | ||
| 100U/mL penicillin and 100U/mL streptomycin | Used during the air-liquid interface of organotypic cultures. This media is added to the outside of the cell-culture insert. | ||
| 0.4mg/mL hydrocortisone | Used during the air-liquid interface of organotypic cultures. This media is added to the outside of the cell-culture insert. | ||
| 5mg/mL insulin | Used during the air-liquid interface of organotypic cultures. This media is added to the outside of the cell-culture insert. | ||
| 1.8·10-4 M adenine | Used during the air-liquid interface of organotypic cultures. This media is added to the outside of the cell-culture insert. | ||
| 5mg/mL transferrin | Used during the air-liquid interface of organotypic cultures. This media is added to the outside of the cell-culture insert. | ||
| 2·10- 11 M triiodothyronine | Used during the air-liquid interface of organotypic cultures. This media is added to the outside of the cell-culture insert. | ||
| Trypsin | Biopolis Shared Facilities | 0.125% Trypsin/Versene pH 7.0 + 0.3 | Used to trypsinize cells |
References
- Breitkreutz, D., Mirancea, N., Nischt, R. Basement membranes in skin: unique structures with diverse functions. Histochem Cell Biol. 132 (1), 1-10 (2009).
- Lane, E. B., et al. mutation in the conserved helix termination peptide of keratin 5 in hereditary skin blistering. Nature. 356 (6366), 244-246 (1992).
- Fuchs, E., Raghavan, S. Getting under the skin of epidermal morphogenesis. Nat Rev Genet. 3 (3), 199-209 (2002).
- Niessen, C. M. Tight junctions/adherens junctions: basic structure and function. J Invest Dermatol. 127 (11), 2525-2532 (2007).
- Jarvelainen, H., Sainio, A., Koulu, M., Wight, T. N., Penttinen, R. Extracellular matrix molecules: potential targets in pharmacotherapy. Pharmacol Rev. 61 (2), 198-223 (2009).
- Schaefer, L., Schaefer, R. M. Proteoglycans: from structural compounds to signaling molecules. Cell Tissue Res. 339 (1), 237-246 (2010).
- Frantz, C., Stewart, K. M., Weaver, V. M. The extracellular matrix at a glance. J Cell Sci. 123 (Pt 24), 4195-4200 (2010).
- Ghalbzouri, A., Jonkman, M., Dijkman, R., Ponec, M. Basement membrane reconstruction in human skin equivalents is regulated by fibroblasts and/or exogenously activated keratinocytes. J Invest Dermatol. 124 (1), 79-86 (2005).
- Lareu, R. R., Arsianti, I., Harve, K. S., Peng, Y. X., Raghunath, M. In Vitro Enhancement of Collagen Matrix Formation and Crosslinking for Applications in Tissue Engineering–a Preliminary Study. Tiss Eng. 13 (2), 385-391 (2007).
- Lareu, R. R., et al. Collagen matrix deposition is dramatically enhanced in vitro when crowded with charged macromolecules: the biological relevance of the excluded volume effect. FEBS Lett. 581 (14), 2709-2714 (2007).
- Lareu, R. R., Harve, K. S., Raghunath, M. Emulating a crowded intracellular environment in vitro. dramatically improves RT-PCR performance. Biophys Biochem Res Comm. 363 (1), 171-177 (2007).
- Harve, K. S., Ramakrishnan, V., Rajagopalan, R., Raghunath, M. Macromolecular crowding in vitro as means of emulating cellular interiors: when less might be more. Proc Natl Acad USA Sci. 105 (51), E119 (2008).
- Chen, C., et al. The Scar-in-a-Jar: Studying antifibrotic lead compounds from the epigenetic to extracellular level in a single well. Br J Pharmacol. 158 (5), 1196-1209 (2009).
- Harve, K. S., Lareu, R., Rajagopalan, R., Raghunath, M. Understanding how the crowded interior of cells stabilizes DNA/DNA and DNA/RNA hybrids-in silico predictions and in vitro evidence. Nucleic Acids Res. 38 (1), 172-181 (2009).
- Satyam, A., et al. Macromolecular crowding meets tissue engineering by self-assembly: A paradigm shift in regenerative medicine. Adv Mat. 26 (19), 3024-3034 (2014).
- Chen, C. Z. C., Loe, F., Blocki, A., Peng, Y., Raghunath, M. Applying macromolecular crowding to enhance extracellular matrix deposition and its remodeling in vitro for tissue engineering and cell-based therapies. Adv Drug Deliv Rev. 63 (4-5), 277-290 (2011).
- Rashid, R., et al. Novel use for Polyvinylpyrrolidone as a Macromolecular Crowder for Enhanced Extracellular Matrix Deposition and Cell Proliferation. Tiss Eng C. , (2014).
- Dewavrin, J. Y., Hamzavi, N., Shim, V. P. W., Raghunath, M. Tuning the Architecture of 3D Collagen Hydrogels by Physiological Macromolecular Crowding. Acta Biomaterialia. 10 (10), 4351-4359 (2014).
- Dewavrin, J. Y., et al. Synergistic Rate Boosting of Collagen Fibrillogenesis in Heterogeneous Mixtures of Crowding Agents. J Phys Chem B. 119 (12), 4350-4358 (2015).
- Auger, F. A., Berthod, F., Moulin, V., Pouliot, R., Germain, L. Tissue engineered skin substitutes: from in vitro constructs to in vivo applications. Biotechnol Appl Biochem. 39, 263 (2004).
- Chen, B., et al. Macromolecular crowding effect on cartilaginous matrix production: a comparison of two-dimensional and three-dimensional models. Tiss Eng Part C Methods. 19 (8), 586-595 (2013).
- Zeiger, A. S., Loe, F. C., Li, R., Raghunath, M., van Vliet, K. J. Macromolecular crowding directs extracellular matrix organization and mesenchymal stem cell behavior. PLOS One. 7 (5), e37904 (2012).
- Kumar, P., et al. Macromolecularly crowded in vitro microenvironments accelerate the production of extracellular matrix-rich supramolecular assemblies. Scientific Reports. 5, 8729 (2015).
- Ang, X. M., et al. Macromolecular crowding amplifies adipogenesis of human bone marrow-derived MSCs by enhancing the pro-adipogenic microenvironment. Tiss Eng Part A. 20 (5-6), 966-981 (2014).
- Peng, Y. X., et al. Human Fibroblast Matrices Bioassembled Under Macromolecular Crowding Support Stable Propagation Of Human Embryonic Stem Cells. J Tiss Eng Regen Med. 6 (10), e74-e84 (2012).
- Benny, P., Badowski, C., Lane, E. B., Raghunath, M. Making More Matrix: Enhancing the deposition of dermal-epidermal junction components in vitro and accelerating organotypic skin culture development, using macromolecular crowding. Tiss Eng A. 21 (1-2), 182-192 (2015).
