Fare Hipokampal Astrositler Seks Farkları sonra<em> In-Vitro</em> İskemi
Summary
Astrositler merkezi sinir sistemi (MSS) en önemli anahtar oyunculardan biri bulunmaktadır. Burada, sonra in vitro iskemi erkek ve kadın yeni doğan yavrular astrosit fonksiyonu altında yatan mekanizmaları araştırmak için cinsiyetli hipokampal astrosit kültürü protokolünün pratik bir yöntem bildiriliyor.
Abstract
hipoksi / iskemi (HI) ile ilgili beyin hasarını takiben astrogliasis yenidoğanlarda artmış morbidite ve mortalite bir rol oynar. Son klinik çalışmalar beyin hasarının şiddeti seks bağımlı gibi görünen gösterir ve erkek yenidoğanlarda karşılaştırılabilir beyin hasarı olan kadınlara kıyasla daha ciddi nörolojik sonuçlara yol açan, HI-ilişkili beyin hasarının etkilerine daha duyarlı olduğunu. yalıtmak ve cinsiyette hipokampal astrosit zenginleştirilmiş popülasyonları korumak için güvenilir yöntemlerin geliştirilmesi neonatal HI patolojik sonuçları cinsiyet farklılıklarının hücresel temelini anlamak için esastır. Bu çalışmada, reoksijenasyonun ardından in vitro iskemi, oksijen glukoz yoksunluk bir model maruz cinsiyete spesifik hipokampal astrosit kültürleri oluşturmak için bir yöntem tarif eder. Daha sonra reaktif astrogliasis immunostai ile incelendiGlial fibriller asidik protein (GFAP) ve S100B için Ning. Bu yöntem ayrıca, yenidoğan HI aşağıdaki erkek ve kadın hipokampal astrositler rolünü incelemek için yararlı bir araç sağlar.
Introduction
Astrositler merkezi sinir sistemi (MSS) en önemli anahtar oyunculardan biri bulunmaktadır. kanıt Büyüyen vücut astrositlerin rolleri nöronal destek sağlama daha olduğunu gösterir. Aslında, fizyolojik koşullar altında astrositlerin rolleri gibi, merkezi sinir sistemi, kan akışını düzenleyen 2, gelişmekte olan aksonlar 1 göçünü yol sinaptik dokulararası sıvının 3 pH homeostazını sürdürmek ve kan-beyin bariyerinin katılmak gibi çok karmaşık olabilir 4 ve sinaptik iletim 5. Patolojik koşullar altında, astrositler astrositler ve fonksiyon (zedelenmesinden mesafeye göre) morfolojisi, sayı, yer, topografya heterojen bir şekilde 6,7 değişebilir olan reaktif astrogliasis adı verilen bir işlem ile hasara yanıt. belki yenidoğanların morbidite ve mortalite katkıda yenidoğan hipoksik iskemik ensefalopati aşağıdaki görüldü astrogliasis <s> 8 yukarı.
Son klinik ve deneysel çalışmalar, beyin hasarı şiddeti ile karşılaştırıldığında erkek yenidoğanlarda daha ciddi nörolojik sonuçlara neden hipoksi / iskemi (HI) ile ilgili beyin hasarı etkilerine daha duyarlı olduğunu seks bağımlı gibi görünüyor ve olduğunu göstermektedir karşılaştırılabilir beyin yaralanması 9-11 ile kadın. Yaralanma lokalizasyonu gestasyonel yaş ve süresi ve hakaret şiddetine bağlıdır rağmen, hipokampus dönem yenidoğan HI sonra MSS en çok etkilenen bölgelerden biri olan ve hipokampal astrogliasis up-regülasyonu ile teyit edilmiştir arttı Glial fibriller asidik protein (GFAP) yenidoğan HI 7,10,12,13 sonra 3 gün. Astrosit fonksiyonunda cinsiyet farklılıkları serebral iskemi 14,15 sonrasında yenidoğanlarda ve yetişkin kemirgenlerde gösterilmiştir. Buna ek olarak, in vitro iskemi erkek astrositik hassasiyeti yükselttiği cel ile gösterilmiştirKültür 16 dişi kortikal astrositler göre l ölümü.
Cinsiyet farklılıkları in utero başlar ve ölüm 17 kadar devam eder. Son on yılda, hücre kültürü ve in vivo çalışmalarda deneysel koşullarda cinsiyete dahil önemi Tıp ve NIH Enstitüsü vurgu fizyolojik ve patolojik durumlarda 17,18 görülen cinsiyet farklılıkları temel bilgiyi aramak olmuştur . yalıtmak ve cinsiyette hipokampal astrosit popülasyonlarının korumak için güvenilir yöntemlerin geliştirilmesi neonatal HI patolojik sonuçları cinsiyet farklılıklarının hücresel temelini anlamak için esastır. Bu çalışma Oksijen / Glikoz Yoksunluk (OGD) ve reoksijenasyon (REOX), indükleyici aşağıdaki GFAP-immünoreaktif astrositler rollerini değerlendirmek için yeni doğmuş farelerden zenginleştirilmiş cinsiyete özgü hipokampal astrosit kültürleri hazırlamak için teknikler sağlamak için tasarlanmıştırHücre kültürü ortamı, HI. Bu teknik normoksik ve iskemik koşullarda yenidoğan kadın ve erkeklerde hipokampal astrositler ile ilgili tüm hipotezi test etmek için kullanılabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Fizyolojik ve patolojik koşullar altında astrositlerin cinsiyet özelliklerinin farklılıkları ve fonksiyon çalışma için, hücre kültürü içinde cinsiyette primer astrositler hazırlanması kullanılması için önemli bir araçtır. Bu çalışmada in vitro yenidoğan cinsiyetli hipokampal astrosit yüksek zenginleştirilmiş homojen nüfus (P0-P2) C57BL / 6 (vahşi tip) veya K19F (GFAP null) fare yavrular bir yüksek verimli ve kültürüne bir tekrarlanabilir bir yöntem sunduk. Bu metodoloji olu?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Clinical and Translational Science Award program of NCATS UL1 TR0000427 and KL2 TR000428 (Cengiz P), UL1TR000427 to the UW ICTR from NIH/NCATS and funds from Waisman Center (Cengiz P), K08 NS088563-01A1 from NINDS (Cengiz P) and NIH P30 HD03352 (Waisman Center), NIH/NINDS 1K08NS078113 (Ferrazzano P). We would like to thank Albee Messing, PhD, for providing us the GFAP knockout mice.
Materials
| Astrocyte culture media | |||
| DMEM, high glucose | cellgro | 10-013-CV | |
| Horse serum | Gibco | 26050-070 | Final Concentration: 10% |
| Penicillin-Streptomycin | Cellgro | 30-002-CI | Final Concentration: 1% |
| L-Leucine methyl ester hydrochloride | Aldrich | L1002-25G | Final Concentration: 5 mM |
| Solution for brain tissue digestion | |||
| HBSS | Life Technologies | 14170-088 | |
| 0.25% Trypsin | cellgro | 25-050-CI | Final Concentration: 0.25% |
| Other | |||
| 70% (vol/vol) ethanol | Roth | 9065.2 | |
| Poly-D-Lysine 12mm round coverslips | Corning | 354087 | |
| Water | Sigma | W3500 | cell culture grade |
| PBS | cellgro | 21-040-CV | cell culture grade |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25300-062 | |
| 70 μm Sterile cell strainer | Fisher scientific | 22363548 | |
| 3.5 cm petri dish | BD Falcon | 353001 | |
| 15 ml Falcon tube | BD Falcon | 352096 | |
| 50 ml Falcon tube | BD Falcon | 352070 | |
| Forceps, fine | Dumont | 2-1032; 2-1033 | # 3c; # 5 |
| Forceps, flat tip | KLS Martin | 12-120-11 | |
| 13 cm surgical scissors | Aesculap | BC-140-R | |
| Confocal Microscope | Nikon | A1RSi | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5805000.017 | Centrifuge5804R |
| Orbital Shaker | Thermo Scientific | SHKE 4450-1CE | MaxQ 4450 |
| Anti-IBA1 | Wako | 019-19741 | Rabbit monoclonal |
| Anti-MAP2 | Sigma | M2320 | Mouse monoclonal |
| Anti-HIF1alpha | abcam | ab179483 | rabbit monoclonal |
| Anti-S100B | Sigma | HPA015768 | Rabbit polyclonal |
| Anti-GFAP (cocktail) | Biolegend | 837602 | |
| VECTASTAIN Elite ABC Kit (Rabbit IgG) | Vector Labs | PK-6101 | Contains 4 Reagents |
| Goat Anti Rabbit Alexa-Fluor 488 | Invitrogen | A11070 | |
| Goat Anti Mouse Alexa-Fluor 568 | Invitrogen | A11004 | |
References
- Powell, E. M., Geller, H. M. Dissection of astrocyte-mediated cues in neuronal guidance and process extension. Glia. 26, 73-83 (1999).
- Koehler, R. C., Roman, R. J., Harder, D. R. Astrocytes and the regulation of cerebral blood flow. Trends in neurosciences. 32, 160-169 (2009).
- Seifert, G., Schilling, K., Steinhauser, C. Astrocyte dysfunction in neurological disorders: a molecular perspective. Nature reviews. Neuroscience. 7, 194-206 (2006).
- Ballabh, P., Braun, A., Nedergaard, M. The blood-brain barrier: an overview: structure, regulation, and clinical implications. Neurobiology of disease. 16, 1-13 (2004).
- Araque, A., Parpura, V., Sanzgiri, R. P., Haydon, P. G. Tripartite synapses: glia, the unacknowledged partner. Trends in neurosciences. 22, 208-215 (1999).
- Anderson, M. A., Ao, Y., Sofroniew, M. V. Heterogeneity of reactive astrocytes. Neuroscience letters. 565, 23-29 (2014).
- Cengiz, P., et al. Inhibition of Na+/H+ exchanger isoform 1 is neuroprotective in neonatal hypoxic ischemic brain injury. Antioxidants & redox signaling. 14, 1803-1813 (2011).
- Ferriero, D. M. Neonatal brain injury. The New England journal of medicine. 351, 1985-1995 (2004).
- Hill, C. A., Fitch, R. H. Sex differences in mechanisms and outcome of neonatal hypoxia-ischemia in rodent models: implications for sex-specific neuroprotection in clinical neonatal practice. Neurol Res Int. , 1-9 (2012).
- Cikla, U., et al. ERalpha Signaling Is Required for TrkB-Mediated Hippocampal Neuroprotection in Female Neonatal Mice after Hypoxic Ischemic Encephalopathy(1,2,3). eNeuro. 3, (2016).
- Uluc, K., et al. TrkB receptor agonist 7, 8 dihydroxyflavone triggers profound gender- dependent neuroprotection in mice after perinatal hypoxia and ischemia. CNS Neurol Disord Drug Targets. 12, 360-370 (2013).
- Cikla, U., et al. Suppression of microglia activation after hypoxia-ischemia results in age-dependent improvements in neurologic injury. J Neuroimmunol. 291, 18-27 (2016).
- McQuillen, P. S., Ferriero, D. M. Selective vulnerability in the developing central nervous system. Pediatr Neurol. 30, 227-235 (2004).
- Morken, T. S., et al. Altered astrocyte-neuronal interactions after hypoxia-ischemia in the neonatal brain in female and male rats. Stroke; a journal of cerebral circulation. 45, 2777-2785 (2014).
- Chisholm, N. C., Sohrabji, F. Astrocytic response to cerebral ischemia is influenced by sex differences and impaired by aging. Neurobiology of disease. 85, 245-253 (2016).
- Liu, M., Oyarzabal, E. A., Yang, R., Murphy, S. J., Hurn, P. D. A novel method for assessing sex-specific and genotype-specific response to injury in astrocyte culture. Journal of neuroscience methods. 171, 214-217 (2008).
- . Exploring the biological contributions to human health: does sex matter?. Journal of women’s health & gender-based. 10, 433-439 (2001).
- Collins, F. S., Tabak, L. A. Policy: NIH plans to enhance reproducibility. Nature. 505, 612-613 (2014).
- Zhang, Y., et al. Rapid single-step induction of functional neurons from human pluripotent stem cells. Neuron. 78, 785-798 (2013).
- Cengiz, P., et al. Sustained Na+/H+ exchanger activation promotes gliotransmitter release from reactive hippocampal astrocytes following oxygen-glucose deprivation. PloS one. 9, e84294 (2014).
- Landis, S. C., et al. A call for transparent reporting to optimize the predictive value of preclinical research. Nature. 490, 187-191 (2012).
- Hamby, M. E., Uliasz, T. F., Hewett, S. J., Hewett, J. A. Characterization of an improved procedure for the removal of microglia from confluent monolayers of primary astrocytes. J Neurosci Methods. 150, 128-137 (2006).
- McClive, P. J., Sinclair, A. H. Rapid DNA extraction and PCR-sexing of mouse embryos. Molecular reproduction and development. 60, 225-226 (2001).
- Wolterink-Donselaar, I. G., Meerding, J. M., Fernandes, C. A method for gender determination in newborn dark pigmented mice. Lab Anim (NY). 38, 35-38 (2009).
- Uliasz, T. F., Hamby, M. E., Jackman, N. A., Hewett, J. A., Hewett, S. J. Generation of primary astrocyte cultures devoid of contaminating microglia. Methods Mol Biol. 814, 61-79 (2012).
- Raponi, E., et al. S100B expression defines a state in which GFAP-expressing cells lose their neural stem cell potential and acquire a more mature developmental stage. Glia. 55, 165-177 (2007).
- Souza, D. G., Bellaver, B., Souza, D. O., Quincozes-Santos, A. Characterization of adult rat astrocyte cultures. PloS one. 8, e60282 (2013).
- Puschmann, T. B., Dixon, K. J., Turnley, A. M. Species differences in reactivity of mouse and rat astrocytes in vitro. Neuro-Signals. 18, 152-163 (2010).
- Schildge, S., Bohrer, C., Beck, K., Schachtrup, C. Isolation and culture of mouse cortical astrocytes. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2013).
- Saura, J. Microglial cells in astroglial cultures: a cautionary note. J Neuroinflammation. 4 (26), (2007).
