마우스 해마 성상에서 섹스 차이점 후<em> 인 체외</em> 허혈
Summary
성상 세포는 중추 신경계 (CNS)에서 가장 중요한 핵심 선수 중 하나이다. 여기서는 후 시험관 허혈 암수 신생아 새끼의 성상 세포 기능의 기초가되는 메카니즘을 연구하기 위해 거세 해마 성상 세포 배양 프로토콜의 구체적인 방법을보고하고있다.
Abstract
저산소증 / 국소 빈혈 (HI) – 관련 뇌 손상 다음 Astrogliosis는 신생아의 증가 이환율과 사망률의 역할을한다. 최근의 임상 연구는 뇌 손상의 정도 섹스 의존적으로 나타난 나타내고, 수형 신생아는 유사한 뇌 손상과 여자에 비해 더 심한 신경 결과 결과 HI 관련된 뇌 손상의 영향에 더 민감하다있다. 분리하고 성별화 된 해마 성상 세포의 매우 풍부한 인구를 유지하기 위해 신뢰할 수있는 방법의 개발은 신생아 HI의 병리 결과에서 성별 차이의 세포 기초를 이해하는 것이 필수적이다. 본 연구에서는 재산 소화 하였다 시험관 허혈, 산소 – 글루코스 부족의 모델을 거치게되는 특정한 성별 해마 성상 세포 배양 물을 생성하는 방법을 설명한다. 이후 반응 astrogliosis는 immunostai에 의해 조사 하였다아교 섬유 성 산성 단백질 (GFAP) 및 S100B에 대한 닝. 이 방법은 개별적으로, 신생아 HI 다음 남성과 여성의 해마 성상 세포의 역할을 연구하는 유용한 도구를 제공합니다.
Introduction
성상 세포는 중추 신경계 (CNS)에서 가장 중요한 핵심 선수 중 하나이다. 증거의 성장 몸은 성상 세포의 역할이 신경 지원을 제공보다 더 있음을 나타냅니다. 사실, 생리 학적 조건에서 아스트로 사이트의 역할은, CNS 혈류량이 조절 현상 축삭 (1)의 이동을 안내하는 시냅스 간질 액 (3)의 pH의 항상성을 유지하고, 혈액 뇌 장벽에 참여 같이 매우 복잡 할 수있다 4 시냅스 전달 (5). 병적 인 조건에서 성상 세포는 성상 세포와 기능 (모욕으로부터의 거리에 대한) 형태, 수, 위치, 지형이 이종 방법 6,7에서 변경 될 수있는 반응 astrogliosis라는 과정을 부상으로 반응한다. 아마 신생아의 이환율과 사망률에 기여 신생아 저산소 성 허혈성 뇌증 다음 볼 Astrogliosis <s> 8입니다.
최근의 임상 및 실험적 연구는 뇌 손상의 정도를 비교하여 수형 신생아는 심한 신경 결과 결과 저산소증 / 허혈 (HI) – 관련 뇌 손상의 영향에 더 민감하다 섹스 의존적으로 나타나고 있음을 나타낸다 비교 뇌 손상 9-11와 여성. 부상의 위치 파악은 임신 기간 및 지속 기간 및 모독의 정도에 따라 다르지만, 해마 용어 신생아 HI 후 CNS에서 가장 흔히 영향 영역 중 하나이며, 해마 astrogliosis가 상향 조절로 확인되었다 증가 아교 섬유 성 산성 단백질 (GFAP) 신생아 HI 7,10,12,13 후 3 일. 성상 세포 기능의 성별 차이는 뇌허혈 14, 15 후 모두 신생아와 성인 설치류에 나타내었다. 또한, 체외 허혈에 남성 성상 세포 감수성이 증가 CEL으로 나타났다문화 (16) 여성 대뇌 피질 성상 세포에 비해 리터의 죽음.
성별 차이에-자궁 시작과 죽음 (17)까지 계속. 지난 10 년간, 세포 배양 및 생체 내 연구 실험 조건에서 남녀 등의 중요성은 의학 및 NIH 연구소의 강조는 생리적, 병리 적 상태 (17, 18)을 볼 성별의 차이에 기초 지식을 추구 할 수 있었다 . 분리하고 성별화 된 해마 성상 세포의 인구를 유지하기 위해 신뢰할 수있는 방법의 개발은 신생아 HI의 병리 결과에서 성별 차이의 세포 기초를 이해하는 것이 필수적이다. 본 연구는 산소가 / 포도당 박탈 (OGD) 및 재산 소화 (REOX), 유도 다음 GFAP 면역 성상 세포의 역할을 평가하기 위해 신생아 쥐에서 농축 성 별 해마 성상 세포 배양을 준비하기 위해 기술을 제공하도록 설계되었습니다세포 배양 환경에서 HI. 이 기술은 정상 산소 및 허혈성 조건 신생아 암수 해마 성상에 속하는 모든 가설을 테스트하기 위해 사용될 수있다.
Protocol
Representative Results
Discussion
생리적 및 병리 적 조건에서 아스트로 성 특성의 차이 및 기능을 연구하기 위해, 세포 배양에서 거세 일차 성상의 제조 활용하는 중요한 도구이다. 본 연구에서 우리는 체외 신생아에서 성별화 된 해마 성상 세포의 고농축 균질 인구 (P0-P2) C57BL / 6 (야생형) 또는 K19F (GFAP 널) 마우스 새끼 고효율과 문화에 재현 방법을보고합니다. 이 방법을 설정하면 연구자는 시험관 허혈 후 성별화 된…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Clinical and Translational Science Award program of NCATS UL1 TR0000427 and KL2 TR000428 (Cengiz P), UL1TR000427 to the UW ICTR from NIH/NCATS and funds from Waisman Center (Cengiz P), K08 NS088563-01A1 from NINDS (Cengiz P) and NIH P30 HD03352 (Waisman Center), NIH/NINDS 1K08NS078113 (Ferrazzano P). We would like to thank Albee Messing, PhD, for providing us the GFAP knockout mice.
Materials
| Astrocyte culture media | |||
| DMEM, high glucose | cellgro | 10-013-CV | |
| Horse serum | Gibco | 26050-070 | Final Concentration: 10% |
| Penicillin-Streptomycin | Cellgro | 30-002-CI | Final Concentration: 1% |
| L-Leucine methyl ester hydrochloride | Aldrich | L1002-25G | Final Concentration: 5 mM |
| Solution for brain tissue digestion | |||
| HBSS | Life Technologies | 14170-088 | |
| 0.25% Trypsin | cellgro | 25-050-CI | Final Concentration: 0.25% |
| Other | |||
| 70% (vol/vol) ethanol | Roth | 9065.2 | |
| Poly-D-Lysine 12mm round coverslips | Corning | 354087 | |
| Water | Sigma | W3500 | cell culture grade |
| PBS | cellgro | 21-040-CV | cell culture grade |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25300-062 | |
| 70 μm Sterile cell strainer | Fisher scientific | 22363548 | |
| 3.5 cm petri dish | BD Falcon | 353001 | |
| 15 ml Falcon tube | BD Falcon | 352096 | |
| 50 ml Falcon tube | BD Falcon | 352070 | |
| Forceps, fine | Dumont | 2-1032; 2-1033 | # 3c; # 5 |
| Forceps, flat tip | KLS Martin | 12-120-11 | |
| 13 cm surgical scissors | Aesculap | BC-140-R | |
| Confocal Microscope | Nikon | A1RSi | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5805000.017 | Centrifuge5804R |
| Orbital Shaker | Thermo Scientific | SHKE 4450-1CE | MaxQ 4450 |
| Anti-IBA1 | Wako | 019-19741 | Rabbit monoclonal |
| Anti-MAP2 | Sigma | M2320 | Mouse monoclonal |
| Anti-HIF1alpha | abcam | ab179483 | rabbit monoclonal |
| Anti-S100B | Sigma | HPA015768 | Rabbit polyclonal |
| Anti-GFAP (cocktail) | Biolegend | 837602 | |
| VECTASTAIN Elite ABC Kit (Rabbit IgG) | Vector Labs | PK-6101 | Contains 4 Reagents |
| Goat Anti Rabbit Alexa-Fluor 488 | Invitrogen | A11070 | |
| Goat Anti Mouse Alexa-Fluor 568 | Invitrogen | A11004 | |
References
- Powell, E. M., & Geller, H. M. Dissection of astrocyte-mediated cues in neuronal guidance and process extension. Glia. 26, 73-83 (1999).
- Koehler, R. C., Roman, R. J., & Harder, D. R. Astrocytes and the regulation of cerebral blood flow. Trends in neurosciences. 32, 160-169 (2009).
- Seifert, G., Schilling, K., & Steinhauser, C. Astrocyte dysfunction in neurological disorders: a molecular perspective. Nature reviews. Neuroscience. 7, 194-206 (2006).
- Ballabh, P., Braun, A., & Nedergaard, M. The blood-brain barrier: an overview: structure, regulation, and clinical implications. Neurobiology of disease. 16, 1-13 (2004).
- Araque, A., Parpura, V., Sanzgiri, R. P., & Haydon, P. G. Tripartite synapses: glia, the unacknowledged partner. Trends in neurosciences. 22, 208-215 (1999).
- Anderson, M. A., Ao, Y., & Sofroniew, M. V. Heterogeneity of reactive astrocytes. Neuroscience letters. 565, 23-29 (2014).
- Cengiz, P. et al. Inhibition of Na+/H+ exchanger isoform 1 is neuroprotective in neonatal hypoxic ischemic brain injury. Antioxidants & redox signaling. 14, 1803-1813 (2011).
- Ferriero, D. M. Neonatal brain injury. The New England journal of medicine. 351, 1985-1995 (2004).
- Hill, C. A., & Fitch, R. H. Sex differences in mechanisms and outcome of neonatal hypoxia-ischemia in rodent models: implications for sex-specific neuroprotection in clinical neonatal practice. Neurol Res Int. 2012, 1-9 (2012).
- Cikla, U. et al. ERalpha Signaling Is Required for TrkB-Mediated Hippocampal Neuroprotection in Female Neonatal Mice after Hypoxic Ischemic Encephalopathy(1,2,3). eNeuro. 3 (2016).
- Uluc, K. et al. TrkB receptor agonist 7, 8 dihydroxyflavone triggers profound gender- dependent neuroprotection in mice after perinatal hypoxia and ischemia. CNS Neurol Disord Drug Targets. 12, 360-370 (2013).
- Cikla, U. et al. Suppression of microglia activation after hypoxia-ischemia results in age-dependent improvements in neurologic injury. J Neuroimmunol. 291, 18-27 (2016).
- McQuillen, P. S., & Ferriero, D. M. Selective vulnerability in the developing central nervous system. Pediatr Neurol. 30, 227-235. (2004).
- Morken, T. S. et al. Altered astrocyte-neuronal interactions after hypoxia-ischemia in the neonatal brain in female and male rats. Stroke; a journal of cerebral circulation. 45, 2777-2785 (2014).
- Chisholm, N. C., & Sohrabji, F. Astrocytic response to cerebral ischemia is influenced by sex differences and impaired by aging. Neurobiology of disease. 85, 245-253 (2016).
- Liu, M., Oyarzabal, E. A., Yang, R., Murphy, S. J., & Hurn, P. D. A novel method for assessing sex-specific and genotype-specific response to injury in astrocyte culture. Journal of neuroscience methods. 171, 214-217 (2008).
- Exploring the biological contributions to human health: does sex matter? Journal of women's health & gender-based medicine. 10, 433-439 (2001).
- Collins, F. S., & Tabak, L. A. Policy: NIH plans to enhance reproducibility. Nature. 505, 612-613 (2014).
- Zhang, Y. et al. Rapid single-step induction of functional neurons from human pluripotent stem cells. Neuron. 78, 785-798 (2013).
- Cengiz, P. et al. Sustained Na+/H+ exchanger activation promotes gliotransmitter release from reactive hippocampal astrocytes following oxygen-glucose deprivation. PloS one. 9, e84294 (2014).
- Landis, S. C. et al. A call for transparent reporting to optimize the predictive value of preclinical research. Nature. 490, 187-191 (2012).
- Hamby, M. E., Uliasz, T. F., Hewett, S. J., & Hewett, J. A. Characterization of an improved procedure for the removal of microglia from confluent monolayers of primary astrocytes. J Neurosci Methods. 150, 128-137. (2006).
- McClive, P. J., & Sinclair, A. H. Rapid DNA extraction and PCR-sexing of mouse embryos. Molecular reproduction and development. 60, 225-226 (2001).
- Wolterink-Donselaar, I. G., Meerding, J. M., & Fernandes, C. A method for gender determination in newborn dark pigmented mice. Lab Anim (NY). 38, 35-38. (2009).
- Uliasz, T. F., Hamby, M. E., Jackman, N. A., Hewett, J. A., & Hewett, S. J. Generation of primary astrocyte cultures devoid of contaminating microglia. Methods Mol Biol. 814:61-79., (2012).
- Raponi, E. et al. S100B expression defines a state in which GFAP-expressing cells lose their neural stem cell potential and acquire a more mature developmental stage. Glia. 55, 165-177 (2007).
- Souza, D. G., Bellaver, B., Souza, D. O., & Quincozes-Santos, A. Characterization of adult rat astrocyte cultures. PloS one. 8, e60282 (2013).
- Puschmann, T. B., Dixon, K. J., & Turnley, A. M. Species differences in reactivity of mouse and rat astrocytes in vitro. Neuro-Signals. 18, 152-163 (2010).
- Schildge, S., Bohrer, C., Beck, K., & Schachtrup, C. Isolation and culture of mouse cortical astrocytes. Journal of visualized experiments : JoVE. (2013).
- Saura, J. Microglial cells in astroglial cultures: a cautionary note. J Neuroinflammation. 4, 26 (2007).
