Убыт- и Gain-оф-функции подход к расследованию Early Cell Судьба определителям предимплантационной эмбрионов мыши
Summary
Цель этого протокола заключается в описании убыт- и амплитудно-метода функции, который применим для идентификации neogenin в качестве рецептора стадиеспецифический, что приводит к трофэктодерме и массовая дифференциация внутренней клеточной у эмбрионов предимплантационной мыши.
Abstract
Gene silencing and overexpression techniques are instrumental for the identification of genes involved in embryonic development. Direct target gene modification in preimplantation embryos provides a means to study the underlying mechanisms of genes implicated in, for instance, cellular differentiation into the trophectoderm (TE) and the inner cell mass (ICM). Here, we describe a protocol that examines the role of neogenin as an authentic receptor for initial cell fate determination in preimplantation mouse embryos. First, we discuss the experimental manipulations that were used to produce gain and loss of neogenin function by microinjecting neogenin cDNA and shRNA; the effectiveness of this approach was confirmed by a strong correlation between the pair-wise expression levels of either red fluorescent protein (RFP) or green fluorescent protein (GFP) and the immunocytochemical quantification of neogenin expression. Secondly, overexpression of neogenin in preimplantation mouse embryos leads to normal ICM development while neogenin knockdown causes the ICM to develop abnormally, implying that neogenin could be a receptor that relays extracellular cues to drive blastomeres to early cell fates. Given the success of this detailed protocol in investigating the function of a novel embryonic developmental stage-specific receptor, we propose that it has the potential to aid in exploration and identification of other stage-specific genes during embryogenesis.
Introduction
Преимплантационная эмбриональное развитие можно разделить на несколько различных стадий, от стадии одной клетки к морулы и бластоцисты. Многое данные свидетельствуют о том, что полярность и позиционные сигналы играют роль в раннем определении судьбы клеток в трофэктодерме (TE) и массы внутренней клетки (ИВМ). Тем не менее, характер репликами, как они преобразованных в клеточные сигналы, а также физиологические условия, в которых такие сигналы способны инициировать клеточной линии дифференцировки не известны. Эти дифференцированные клетки затем проходят специализацию, начинает приобретать характерные структуры и функции , необходимые для правильного формирования эмбриона и роста плаценты 1-3.
Предимплантационной эмбрионов особенно поддаются манипулированию путем прямой инъекции модифицированных генетических материалов, таких как миРНК или кДНК-мишени и, таким образом, могут быть использованы для изучения конкретных молекул-мишеней. Существует растущее понимание того, что генетическаяанализ эмбрионов позвоночных имеет решающее значение для углубления нашего понимания эмбрионального развития 4. Точное введение гена дикого типа или мутантной формы в эмбрион в своевременном контексте для достижения амплитудно или с потерей функции гена значительно облегчило изучение онтогенетически регулируемых генов. Убыт- и амплитудно-оф-функции с помощью микроинъекции генетических материалов в отдельных ранних эмбрионов не млекопитающих и млекопитающих сравнительно просто из – за их большого размера и большой восприимчивостью 5. Микроинъекция обычно выполняется с использованием не-вирусные векторы. Особое преимущество было принято за легкости использования невирусных векторов над вирусными векторами и трансгенов. Быстрое убыт- или система экспрессии усиления из-функции у эмбрионов мышей была разработана , что позволяет анализировать и понять функции генов в позвоночном эмбриологии 6,7.
Флуоресцентным эмбрионов значительно облегчит выбор MICRoinjected или генетически модифицированных эмбрионов и в то же время предоставляют средство для непрямого количественную оценку уровня экспрессии микроинъецировали миРНК или кДНК , основанный на интенсивности флуоресценции 8. Для выполнения этой маркировки, флуоресцентный белок, кДНК GFP или RFP, являются совместно вводят либо в виде слитых конструкций или по отдельности. Интенсивность флуоресценции GFP или RFP показывает степень экспрессии миРНК или чужеродной ДНК, чтобы гарантировать, что убыт- или получить его функции, было достигнуто.
Здесь мы приводим протокол микроманипуляций для убыт- и усиления посещающих функции методики, которая позволила нам идентифицировать neogenin как рецептор, который передает внеклеточные сигналы важные в начале дифференцировки клеток у эмбрионов предимплантационной мыши.
Protocol
Representative Results
Discussion
В настоящем протоколе, мы демонстрируем новые способы микроинъекции генетических материалов, либо кДНК или shRNA, в эмбрионах 2-ПН мыши, чтобы исследовать роль neogenin в ранней дифференцировки клеток во время эмбриогенеза мыши. Генетическая модификация предимплантационной эмбрионов являе?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы также хотели бы отметить группу доктора Сюна в Грузии медицинских наук университета для производства и обмена конструкций для neogenin кДНК и shRNA векторов. Это исследование было поддержано грантами Программы фундаментальных исследований (Science 2013R1A1A4A01012572), финансируемого Фондом Корейского научно-исследовательского и научно-исследовательского гранта от Sahmyook университета.
Materials
| M16 medium, | Gibco BRL (Grand Island, NY) | M7292 LOT# 11A832 | |
| Goat serum, | Dako (Glostrup, Denmark) | X0907 | |
| PMSG | Folligon, Intervet, Holland | G4877-1000IU LOT#SLBD0719V | |
| Mineral olie | Sigma Aldrich | CG5-1VL LOT# SLBC6783V | |
| human chorionic gonadotropin and pregnant mare serum gonadotropin | (Intervet, Holland) | (invitrogen , 15596-026) | |
| SuperScript® III Reverse Transcriptase | lifetechnologies | 18080-044 | |
| PCR pre mixture | (Bioneer, Daejon, S. Korea) | GenDEPOT , A0224-050 | |
| Agarose (molecular grade) | BioRad | 161-3101 | |
| Paraformaldehyde Solution, 4% in PBS | Affymetrix USA | 19943 | |
| polyclonal rabbit anti-neogenin antibody | Santa Cruz Biotechnology, US | SC-15337 | |
| Alexa fluor 488 labeled anti-rabbit antibody | Molecular Probes (Invitrogen, USA) | A-11094 | |
| Alexa fluor 555 labeled anti-rabbit antibody | Molecular Probes (Invitrogen, USA) | A-21428 | |
| Alexa Fluor® 555 Phalloidin | Molecular Probes (Invitrogen, USA) | A34055 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Invitrogen, USA | D1306 | |
| Recombinant Human RGM-C/Hemojuvelin | R&D systems | 3720-RG | |
| all plasmid constructs | Prof. Wen Cheng Xiong at Georgia Health Sciences University (Agusta, GA). | the present studies were kindly provided by | |
| Neon® Transfection System | lifetech | MPK10096 | |
| Stereo Microscrope | Nikon | SMZ1000 | |
| Micromainpulation system with Nikon | Nikon | Narishige ONM-1 | |
| MicroInjector | Nikon Narishige | GASTIGHT #1750 | |
| Holder | Nikon Narishige | Narishige IM 16 | |
| Microfoge | Nikon Narishige | Narishige MF-900 | |
| grinder | Narishige | EG400 | |
| Puller | Sutter Instrumnet company | P-97 | |
| CO2 incubator | Thermo Scientific Forma | EW-39320-16 | |
| Veriti® 384-Well Thermal Cycler | lifetechnologies | 4388444 |
References
- Yamanaka, Y., Ralston, A., Stephenson, R. O., Rossant, J. Cell and molecular regulation of the mouse blastocyst. Dev. Dyn. 235 (9), 2301-2314 (2006).
- Sasaki, H. Mechanisms of trophectoderm fate specification in preimplantation mouse development. Dev. Growth Differ. 52 (3), 263-273 (2010).
- Nishioka, N., Yamamoto, S., Kiyonari, H., Sato, H., Sawada, A., Ota, M., et al. Tead4 is required for specification of trophectoderm in pre-implantation mouse. Mech. Dev. 125 (3-4), 270-283 (2008).
- Ovitt, C. E., Schöler, H. R. The molecular biology of Oct-4 in the early mouse embryo. Mol. Hum. Reprod. 4 (11), 1021-1031 (1998).
- Stein, P., Schindler, K. Mouse Oocyte Microinjection, Maturation and Ploidy Assessment. J. Vis. Exp. (53), e2851 (2011).
- Shin, M. R., Cui, X. S., Jun, J. H., Jeong, Y. J., Kim, N. H. Identification of mouse blastocyst genes that are down regulated by double-stranded RNA-mediated knockdown of Oct-4 expression. Mol. Reprod. Dev. 70 (4), 390-396 (2005).
- Khang, I., Sonn, S., Park, J. -. H., Rhee, K., Park, D., Kim, K. Expression of epithin in mouse preimplantation development: Its role in compaction. Dev. Biol. 281, 134-144 (2005).
- Prieto, D., Aparicio, G., Machado, M., Zolessi, F. R. Application of the DNA-Specific Stain Methyl Green in the Fluorescent Labeling of Embryos. J. Vis. Exp. (99), e52769 (2015).
- Lee, J. H., Choi, S. S., Kim, H. W., Xiong, W. C., Min, C. K., Lee, S. J. Neogenin as a receptor for early cell fate determination in preimplantation mouse embryos. PLoS One. 9 (7), e101989 (2014).
- Gordon, J. W., Scangos, G. A., Plotkin, D. J., Barbosa, J. A., Ruddle, F. H. Genetic transformation of mouse embryos by microinjection of purified DNA. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 77 (12), 7380-7384 (1980).
- Brinster, R. L., Chen, H. Y., Trumbauer, M. E., Yagle, M. K., Palmiter, R. D. Factors affecting the efficiency of introducing foreign DNA into mice by microinjecting eggs. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 82, 4438-4442 (1985).
