쥐 두피 뉴런의 사상 액틴 (F - 굴지) puncta의 정량
Summary
Filamentous actin (F-actin) plays an important role in spinogenesis, synaptic plasticity, and synaptic stability. Quantification of F-actin puncta is therefore a useful tool to study the integrity of synaptic structures. This protocol describes the procedures of quantifying F-actin puncta labeled with Phalloidin in low-density primary cortical neuronal cultures.
Abstract
(F 액틴) 필라멘트 액틴 단백질 spinogenesis 시냅스 가소성 및 시냅스 안정성에 중요한 역할을한다. 수지상 F – 굴지 풍부한 구조의 변화는 시냅스 통합 및 연결에 변경을 제안한다. 여기에서 우리는 F – 굴지 puncta에, 이후의 정량화 기법에 대한 기본 쥐의 대뇌 피질의 뉴런, Phalloidin의 얼룩을 배양하기위한 상세한 프로토콜을 제공합니다. 먼저, E18 쥐 배아 전두엽는, 저밀도 세포 배양에 적어도 12~14일 체외에서 배양 신경 세포 해리된다. 실험 치료 후, 대뇌 피질의 신경 세포가 AlexaFluor 488 Phalloidin의 염색하고 미세 소관 – 관련 단백질 2 (수지상 F – 굴지 puncta의 레이블을) (MAP2을, 신경 세포와 수지상 무결성을 검증하기 위해). 마지막으로, 전문 소프트웨어 분석하고 무작위로 선택된 신경 세포의 수상 돌기를 정량화하는 데 사용됩니다. F는 액틴 풍부한 구조하는 두 번째 순서 수지상 가지 (길이 범위 25 ~ 75 &에 식별# 181; 연속 MAP2의 면역와 m). 여기에 제시된 프로토콜은 실험 치료 이후 수지상 시냅스 구조의 변화를 조사하기위한 유용한 방법이 될 것입니다.
Introduction
본 연구의 주된 목적은 신경 돌기 네트워크 시냅스 무결성 측정 (추정)의 신뢰성있는 방법을 개발하는 것이다. 여기에서 우리는 Phalloidin의 염색 전문 (NIS-요소) 소프트웨어를 사용하여 후속 분석을 수상 돌기의 면역 세포 화학 (ICC) 검출의 조합을 사용하여 기본 쥐 배양 된 신경 세포의 F – 굴지 puncta의 정량화를 설명합니다.
레이블 phallotoxins는 크고 작은 필라멘트 (F-액틴)에 대한 유사한 친 화성을 가지고 있지만, 일부 액틴 항체 1과는 달리, 단량체 구형 액틴 (G-액틴)에 결합하지 않는다. Phalloidin의의 결합 특이성 따라서 세포 이미징 동안 최소한의 배경을 제공 무시할 수있다. Phalloidin의는 일반적으로 Phalloidin의에 의해 F – 굴지의 훨씬 더 강렬한 라벨을 허용 형광 현미경에 대한 세포 단백질을 라벨 사용되는 항체보다 훨씬 작다. 따라서, 뉴런에서 F – 굴지 현지화의 상세한 이미지가 될 수 있습니다레이블 Phalloidin의 사용을 통해 얻을.
Phalloidin의 신경 세포 수상 돌기의 (F – 굴지) 염색 성숙 쪽이 아닌 가시 시냅스 2 미숙 한 쪽을 포함하여 수지상 구조의 다양한 표현 이산 "핫스팟"또는 밝은 "puncta에"를 생성합니다. 미성숙 등뼈 얇은 filopodia 패치 형태의 일부 형태를 포함하고 spinogenesis 3의 개시를 나타낼 수있다. 미성숙 가시 및 비 – 가시 패치 PSD95 4 부족하다. 뿐만 아니라 등뼈의 후속 변경뿐만 아니라 추가 수지상 구조에 F – 굴지의 납 생산의 변화, 따라서 synaptodendritic 무결성 5-7을 조사하기위한 중요한 도구 Phalloidin의 제작. 일반적으로, Phalloidin의 양성 (F – 굴지) puncta의의 수는 활성 시냅스 사이의 균형 (흥분성과 억제), 굴지 역학과 시냅스 안정성 (8)을 반영한다.
특정 t을 연구하는 중요하지만치료의 대상이 알려지지 않은 경우에 시냅스 (즉, 흥분성 등뼈)의 씨네마 스테이션 먼저 수지상 구조의 다양한 일반 무결성을 추정 할 필요가있다. F – 굴지는 억제 시냅스, synaptopathy을 나타낼 수 F – 굴지 puncta에의 변경 번호를 포함 돌기 쪽과 다른 구조의 주요 구성 요소이기 때문에. 이 synaptopathy는보다 구체적인 변경에 대한 추가 조사를 할 수있다. 여러 시냅스 유형 / 구조를 검출하기위한 우리의 정량화 방법은 다양한 실험적인 치료 다음과 같은 돌기 시냅스 변화 (증가 및 감소)의 전체 추정치를 산출한다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 프로토콜에서는, 우리는 우리가 개별 뉴런의 수상 돌기를 식별 할 수 있습니다 35mm의 유리 바닥 요리 낮은 밀도에서 쥐의 대뇌 피질의 신경 세포를 배양 설명합니다. 다음으로, 우리는 수지상 변화를 감지 할 Phalloidin의 및 MAP2 염색을 사용합니다. 그 후, 우리는 F – 굴지 puncta의 변화를 정량화하는 전문 소프트웨어를 사용했다.
F – 굴지 puncta의 개별 신경 세포의 전체 신경 네…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was funded by NIH grants DA013137, DA031604, and HD043680. Partial support was provided by a NIH T32 training grant in Biomedical-Behavioral science.
Materials
| 35 mm Glass Bottom Dishes No. 1.5 coverglass | MatTek Corporation | P35G-1.5-20-C | |
| DMEM/F12 medium | Life Technologies | 10565-018 | |
| Trypsin-EDTA | Life Technologies | 15400-054 | |
| Poly-L-Lysine | Sigma | P9155 | |
| Boric acid | Sigma | B0252 | |
| Borax | Sigma | B9876 | |
| GlutaMax | Life Technologies | 35050-061 | 100X |
| Glucose | VWR | 101174Y | |
| HBSS | Sigma | H4641 | 10X |
| Neurobasal medium | Life Technologies | 21103-049 | |
| B-27 supplement | Life Technologies | 17504-044 | 50X |
| Antibiotic-Antimycotic solution | Cellgro | 30004CI | 100X |
| Sodium Bicarbonate | Life Technologies | 25080 | |
| Vannas Scissors | World Precision Instruments | 500086 | |
| Iris Scissors | World Precision Instruments | 500216 | |
| Iris Forceps | World Precision Instruments | 15914 | |
| Dumont #7 Forceps | World Precision Instruments | 14097 | |
| Dumont #5 Forceps | World Precision Instruments | 14095 | |
| ProLong Gold | Life Technologies | P36930 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| Cover glass | VWR | 631-0137 | |
| AlexaFluor 488 Phalloidin | Life Technologies | A12379 | |
| Normal horse serum | Life Technologies | 26050-070 | |
| Chicken polyclonal anti-MAP2 | abcam | Ab92434 | |
| Alexa Red 594-conjugated goat anti-chicken IgG | Life Technologies | A11042 | |
| NucBlue Live cell stain ReadyProbes Reagent Hoescht 33342 | Life Technologies | R37605 | |
| NIS-Elements software package | Nikon Instruments | ||
| Nikon Eclipse TE2000-E inverted fluorescent computer-controlled microscope | Nikon Instruments | ||
| 0.2 μm Nalgene nylon membrane filter | Fishersci | 151-4020 |
References
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