Kwantificering van draadvormige actine (F-actine) Puncta in Rat corticale neuronen
Summary
Filamentous actin (F-actin) plays an important role in spinogenesis, synaptic plasticity, and synaptic stability. Quantification of F-actin puncta is therefore a useful tool to study the integrity of synaptic structures. This protocol describes the procedures of quantifying F-actin puncta labeled with Phalloidin in low-density primary cortical neuronal cultures.
Abstract
Filamenteus actine eiwit (F-actine) speelt een belangrijke rol in spinogenesis, synaptische plasticiteit, en synaptische stabiliteit. Veranderingen in de dendritische F-actine rijke structuren suggereren veranderingen in de synaptische integriteit en connectiviteit. Hier hebben we een gedetailleerd protocol voor het kweken van primaire rat corticale neuronen, Phalloidin kleuring voor F-actine puncta, en de daaropvolgende kwantificatie technieken. Ten eerste, de frontale cortex van de rat E18 embryo's worden gescheiden in een lage dichtheid celcultuur, dan de neuronen gekweekt in vitro gedurende ten minste 12-14 dagen. Volgende experimentele behandeling worden de corticale neuronen gekleurd met AlexaFluor 488 Phalloidin en microtubule-geassocieerd eiwit 2 (de dendritische F-actine puncta label) (MAP2, de neuronale cellen en dendritische integriteit valideren). Ten slotte wordt de gespecialiseerde software die wordt gebruikt om te analyseren en te kwantificeren willekeurig gekozen neuronale dendrieten. F-actine rijke structuren worden geïdentificeerd aan de tweede orde dendritische takken (lengte range 25-75 &# 181; m) met doorlopende MAP2 immunofluorescentie. Het protocol hier gepresenteerde een bruikbare methode voor het onderzoeken van veranderingen in dendritische structuren synaps na experimentele behandelingen.
Introduction
Het primaire doel van dit onderzoek is een betrouwbare meetmethode (schatting) van synaptische integriteit van de neuronale dendritische netwerk te ontwikkelen. Hier beschrijven we kwantificering van F-actine puncta in primaire rat gekweekte neuronen met een combinatie van Phalloidin kleuring en immunocytochemische (ICC) detectie van dendrieten met daaropvolgende analyse met behulp van gespecialiseerde (NIS-elementen) software.
Gelabelde phallotoxins soortgelijke affiniteit voor zowel grote als kleine filamenten (F-actine), maar niet binden aan monomere globulaire actine (G-actine), in tegenstelling tot sommige actine antilichamen 1. Niet-specifieke binding van Phalloidin verwaarloosbaar, waardoor minimale achtergrond tijdens cellulaire beeldvorming. Phalloidin is veel kleiner dan antilichamen die typisch zou worden gebruikt om cellulaire eiwitten te labelen voor fluorescentiemicroscopie, die zorgt voor veel intenser etikettering van F-actine met falloïdine. Zo kunnen gedetailleerde beelden van F-actine lokalisatie in neuronenverkregen door het gebruik van gelabelde Phalloidin.
Phalloidin (F-actine) kleuring van neuronale dendrieten genereert discrete "hot spots" of heldere "puncta", die een verscheidenheid van dendritische structuren, met inbegrip van volwassen stekels, niet-stekelige synapsen 2 en onvolwassen stekels vertegenwoordigen. Onrijpe stekels onder dunne filopodia en sommige vormen van patch morfologie, en kunnen de inleiding van spinogenesis 3 vertegenwoordigen. Onrijpe stekels en niet-stekelige flarden missen PSD95 4. Veranderingen in de productie van F-actine leiden tot latere wijzigingen in niet alleen stekels, maar ook extra dendritische structuren, waardoor Phalloidin een belangrijk instrument voor het onderzoeken van synaptodendritic integriteit 5-7. In het algemeen is het aantal Phalloidin-positieve (F-actine) puncta weerspiegelen een evenwicht tussen actieve synapsen (prikkelende en remmende), actine dynamiek en stabiliteit synaps 8.
Hoewel het belangrijk dieper specifieke types synapsen (dwz excitatoire stekels), wanneer het doel van de behandeling is niet bekend moet eerst de algemene integriteit van verschillende dendritische structuren te schatten. Aangezien F-actine is een belangrijke component van spines en andere structuren, waaronder remmende synapsen, een veranderde aantal F-actine puncta kan synaptopathy duiden. Dit synaptopathy kan dan verder worden onderzocht voor meer specifieke aanpassingen. Onze kwantificatie methode voor het opsporen van meerdere synaptische typen / structuren levert een totale raming van dendritische synaptische veranderingen (stijgingen en dalingen) na verschillende experimentele behandelingen.
Protocol
Representative Results
Discussion
In dit protocol beschrijven we het kweken van rat corticale neuronen bij lage dichtheid in 35 mm glazen bodem gerechten die ons in staat stelt om dendrieten van individuele neuronen te identificeren. Vervolgens gebruiken we Phalloidin en MAP2 kleuring dendritische veranderingen te detecteren. Vervolgens gebruikten we gespecialiseerde software veranderingen in F-actine puncta kwantificeren.
Om veranderingen in de F-actine puncta het hele neurale netwerk van een individuele neuron moet duideli…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was funded by NIH grants DA013137, DA031604, and HD043680. Partial support was provided by a NIH T32 training grant in Biomedical-Behavioral science.
Materials
| 35 mm Glass Bottom Dishes No. 1.5 coverglass | MatTek Corporation | P35G-1.5-20-C | |
| DMEM/F12 medium | Life Technologies | 10565-018 | |
| Trypsin-EDTA | Life Technologies | 15400-054 | |
| Poly-L-Lysine | Sigma | P9155 | |
| Boric acid | Sigma | B0252 | |
| Borax | Sigma | B9876 | |
| GlutaMax | Life Technologies | 35050-061 | 100X |
| Glucose | VWR | 101174Y | |
| HBSS | Sigma | H4641 | 10X |
| Neurobasal medium | Life Technologies | 21103-049 | |
| B-27 supplement | Life Technologies | 17504-044 | 50X |
| Antibiotic-Antimycotic solution | Cellgro | 30004CI | 100X |
| Sodium Bicarbonate | Life Technologies | 25080 | |
| Vannas Scissors | World Precision Instruments | 500086 | |
| Iris Scissors | World Precision Instruments | 500216 | |
| Iris Forceps | World Precision Instruments | 15914 | |
| Dumont #7 Forceps | World Precision Instruments | 14097 | |
| Dumont #5 Forceps | World Precision Instruments | 14095 | |
| ProLong Gold | Life Technologies | P36930 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| Cover glass | VWR | 631-0137 | |
| AlexaFluor 488 Phalloidin | Life Technologies | A12379 | |
| Normal horse serum | Life Technologies | 26050-070 | |
| Chicken polyclonal anti-MAP2 | abcam | Ab92434 | |
| Alexa Red 594-conjugated goat anti-chicken IgG | Life Technologies | A11042 | |
| NucBlue Live cell stain ReadyProbes Reagent Hoescht 33342 | Life Technologies | R37605 | |
| NIS-Elements software package | Nikon Instruments | ||
| Nikon Eclipse TE2000-E inverted fluorescent computer-controlled microscope | Nikon Instruments | ||
| 0.2 μm Nalgene nylon membrane filter | Fishersci | 151-4020 |
References
- Heller, E.A., et al. The biochemical anatomy of cortical inhibitory synapses. PLoS One. 7, e39572 (2012).
- Craig, A. M., Blackstone, C. D., Huganir, R. L., Banker G. Selective clustering of glutamate and gamma-aminobutyric acid receptors opposite terminals releasing the corresponding neurotransmitters. Proc Natl Acad Sci USA. 91, 12373-12377 (1994).
- Johnson, O. L., Ouimet, C. C. A regulatory role for actin in dendritic spine proliferation. Brain Res. 1113, 1-9 (2006).
- Rao, A., Craig, A. M. Signaling between the actin cytoskeleton and the postsynaptic density of dendritic spines. Hippocampus. 10 (5), 527-41 (2000).
- Matus, A., Ackermann, M., Pehling, G., Byers, H.R., Fujiwara, K. High actin concentrations in brain dendritic spines and postsynaptic densities. Proc Natl Acad Sci USA. 79, 7590-7594 (1982).
- Allison, D.W., Gelfand, V.I., Spector, I., Craig, A.M. Role of actin in anchoring postsynaptic receptors in cultured hippocampal neurons: differential attachment of NMDA versus AMPA receptors. J Neurosci. 18, 2423-2436 (1998).
- Sekino, Y., Kojima, N., Shirao, T. Role of actin cytoskeleton in dendritic spine morphogenesis. Neurochem Int. 51, 92-104 (2007).
- Zhang W., Benson, D. L. Stages of synapse development defined by dependence on F-actin. J Neurosci. 21 (14), 5169-81 (2001).
- Bertrand, S.J., Aksenova, M.V., Mactutus, C.F., Booze, R.M. HIV-1 Tat protein variants: Critical role for the cysteine region in synaptodendritic injury. Exp Neurol. 248, 228-35 (2013).
- Bertrand, S.J., Mactutus, C.F., Aksenova, M.V., Espensen-Sturges, T.D., Booze, R.M. Synaptodendritic recovery following HIV Tat exposure: neurorestoration by phytoestrogens. J Neurochem. 128(1), 140-51 (2014).
- Lau, P.M., Zucker, R.S., Bentley, D. Induction of filopodia by direct local elevation of intracellular calcium ion concentration. J Cell Biol. 145, 1265-1275 (1999).
