ラット皮質ニューロンにおける繊維状アクチン（F-アクチン）涙点の定量化
Summary
Filamentous actin (F-actin) plays an important role in spinogenesis, synaptic plasticity, and synaptic stability. Quantification of F-actin puncta is therefore a useful tool to study the integrity of synaptic structures. This protocol describes the procedures of quantifying F-actin puncta labeled with Phalloidin in low-density primary cortical neuronal cultures.
Abstract
（F-アクチン）繊維状アクチンタンパク質はspinogenesis、シナプス可塑性、およびシナプスの安定性に大きな役割を果たしています。樹状F-アクチン豊富な構造の変化は、シナプスの完全性と接続性の変化を示唆しています。ここでは、初代ラット皮質ニューロン、F-アクチン斑点のためのファロイジン染色、およびその後の定量化手法を培養するための詳細なプロトコルを提供します。まず、E18ラット胚の前頭皮質は、その後、低密度の細胞培養物中に少なくとも12〜14日間、in vitroで増殖させた神経細胞を解離します。実験的治療に続いて、皮質ニューロンがのAlexaFluor 488ファロイジンで染色され、微小管結合タンパク質2（樹状F-アクチン斑点標識する）（MAP2を、神経細胞や樹状突起の整合性を検証するために）。最後に、特別なソフトウェアがランダムに選択された神経細胞の樹状突起を分析し、定量化するために使用されます。 F-アクチン豊富な構造は、二次樹枝状の枝に識別されます（長さの範囲25-75＆＃181; m）を連続MAP2免疫蛍光を持ちます。ここで紹介するプロトコルは、実験処理に続いて、樹状シナプス構造の変化を調査するための有用な方法となります。
Introduction
この研究の主な目的は、ニューロンの樹状突起ネットワークのシナプス完全性の測定（推定）の信頼性の高い方法を開発することです。ここでは、ファロイジン染色および特殊な（NIS-要素）ソフトウェアを使用して、その後の分析と樹状突起の免疫細胞化学（ICC）の検出の組み合わせを用いて、ラット初代培養神経細胞におけるF-アクチン涙点の定量化について説明します。
標識ファロトキシンは、大小両方のフィラメント（F-アクチン）に対して同様の親和性を有するが、いくつかのアクチン抗体1とは異なり、単量体の球状アクチン（G-アクチン）に結合しません。ファロイジンの非特異的結合は、このように細胞イメージングの間に最小限の背景を提供し、ごくわずかです。ファロイジンは、典型的には、ファロイジンによるF-アクチンのはるかに強い標識化を可能にする蛍光顕微鏡用の細胞タンパク質を標識するために使用される抗体よりもはるかに小さいです。このように、神経細胞におけるF-アクチンの局在の詳細な画像をすることができます標識されたファロイジンを使用することによって得られます。
神経細胞の樹状突起のファロイジン（F-アクチン）染色は、成熟した棘、非とげシナプス2と未熟棘を含む樹枝状構造の多様性を表す離散的「ホットスポット」や明るい「斑点」を生成します。未熟棘薄い糸状仮足及びパッチの形態のいくつかの形態を含み、そしてspinogenesis 3の開始を表すことができます。未熟棘と非とげ状のパッチがPSD95 4を欠いています 。のみならず、棘におけるその後の変化だけでなく、追加の樹枝状構造へのF-アクチンの鉛の生産の変化は、このようにsynaptodendritic整合性5-7を調査するための重要なツールファロイジンを作ります。一般的には、ファロイジン陽性（F-アクチン）涙点の数は、アクティブなシナプス（興奮性および抑制）、アクチンダイナミクスとシナプスの安定性8のバランスを反映しています。
特定のトンを研究することは重要であるが、シナプスのYPES（ すなわち 、興奮棘）、治療の標的が未知であるとき、最初の樹枝状構造体の種々の一般的な整合性を推定する必要があります。 F-アクチンは、抑制性シナプスを含む樹状突起棘および他の構造の主要な構成要素であるので、F-アクチン涙点の変更された数は、シナプス変性症を示すことができます。このシナプス変性症は、より具体的な変化についてさらに調査することができます。複数のシナプスのタイプ/構造を検出するための当社の定量方法は、様々な実験処置後の樹状シナプスの変化（増減）の全体的な推定値が得られます。
Protocol
Representative Results
Discussion
このプロトコルでは、我々は、私たちは、個々の神経細胞の樹状突起を識別することを可能にする35ミリメートルのガラスボトムディッシュで低密度で培養ラット皮質ニューロンを記述する。次に、我々は、樹状変化を検出するファロイジンとMAP2染色を使用します。その後、我々はF-アクチン斑点の変化を定量化するために特別なソフトウェアを使用していました。
F-ア…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was funded by NIH grants DA013137, DA031604, and HD043680. Partial support was provided by a NIH T32 training grant in Biomedical-Behavioral science.
Materials
| 35 mm Glass Bottom Dishes No. 1.5 coverglass | MatTek Corporation | P35G-1.5-20-C | |
| DMEM/F12 medium | Life Technologies | 10565-018 | |
| Trypsin-EDTA | Life Technologies | 15400-054 | |
| Poly-L-Lysine | Sigma | P9155 | |
| Boric acid | Sigma | B0252 | |
| Borax | Sigma | B9876 | |
| GlutaMax | Life Technologies | 35050-061 | 100X |
| Glucose | VWR | 101174Y | |
| HBSS | Sigma | H4641 | 10X |
| Neurobasal medium | Life Technologies | 21103-049 | |
| B-27 supplement | Life Technologies | 17504-044 | 50X |
| Antibiotic-Antimycotic solution | Cellgro | 30004CI | 100X |
| Sodium Bicarbonate | Life Technologies | 25080 | |
| Vannas Scissors | World Precision Instruments | 500086 | |
| Iris Scissors | World Precision Instruments | 500216 | |
| Iris Forceps | World Precision Instruments | 15914 | |
| Dumont #7 Forceps | World Precision Instruments | 14097 | |
| Dumont #5 Forceps | World Precision Instruments | 14095 | |
| ProLong Gold | Life Technologies | P36930 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| Cover glass | VWR | 631-0137 | |
| AlexaFluor 488 Phalloidin | Life Technologies | A12379 | |
| Normal horse serum | Life Technologies | 26050-070 | |
| Chicken polyclonal anti-MAP2 | abcam | Ab92434 | |
| Alexa Red 594-conjugated goat anti-chicken IgG | Life Technologies | A11042 | |
| NucBlue Live cell stain ReadyProbes Reagent Hoescht 33342 | Life Technologies | R37605 | |
| NIS-Elements software package | Nikon Instruments | ||
| Nikon Eclipse TE2000-E inverted fluorescent computer-controlled microscope | Nikon Instruments | ||
| 0.2 μm Nalgene nylon membrane filter | Fishersci | 151-4020 |
References
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