سقالة هندسة الأنسجة عن طريق الحقن تتكون من بولي (N-isopropylacrylamide) -graft-شوندروتن كبريتات أعد (PNIPAAm-ز-CS) المحتوية المجهرية الدقيقة الجينات. ويتم تحليل قوة لاصقة، وتورم الخصائص وفي توافق مع الحياة المختبر في هذه الدراسة. تقنيات توصيف وضعت هنا قد تكون قابلة للتطبيق لأنظمة thermogelling أخرى.
يتم تعريف الحيوية عن طريق الحقن والمواد القابلة للزرع التي يمكن إدخالها في الجسم كسائل وترسيخ في الموقع. هذه المواد توفر مزايا السريرية ليتم زرعها الحد الأدنى جراحية وسهولة تشكيل المواد الصلبة ملء الفضاء في العيوب غير منتظمة الشكل. وقد تم التحقيق على نطاق واسع الحيوية عن طريق الحقن كما السقالات للهندسة الأنسجة. ومع ذلك، من أجل إصلاح بعض المناطق الحاملة في الجسم، مثل القرص الفقرية، السقالات ينبغي أن تمتلك خصائص لاصقة. وهذا التقليل من خطر التفكك أثناء الحركة وضمان اتصال حميم مع الأنسجة المحيطة، وتوفير نقل كاف من القوات. هنا، نحن تصف إعداد وتوصيف سقالة تتألف من حراريا بولي حساسة (N-isopropylacrylamide) كبريتات -graft-الكوندروتن (PNIPAAM-ز-CS) والمجهرية الدقيقة الجينات. كوبوليمر PNIPAAm-ز-CS تشكل حلا لزج في الماء عند RT، إلى التي alginatوالجسيمات العالقة الإلكترونية لتعزيز التصاق. فوق درجة حرارة المحلول أقل الحرجة (LCST)، حوالي 30 درجة مئوية، والبوليمرات تشكل مادة هلامية الصلبة في جميع أنحاء المجهرية الدقيقة. تكيفنا الإجراءات الحيوية توصيف القياسية لتأخذ في الاعتبار المرحلة الانتقالية عكسها من PNIPAAm-ز-CS. وتشير النتائج إلى أن إدراج جزيئات الجينات / 50 مل أو 75 ملغ إلى 5٪ (ث / ت) الحلول PNIPAAm-ز-CS اربعة اضعاف قوة لاصقة الشد من PNIPAAm-GCS وحده (ف <0.05). إدماج المجهرية الدقيقة الجينات أيضا إلى زيادة كبيرة في القدرة تورم PNIPAAm-ز-CS (ع <0.05)، مما يساعد على الحفاظ على هلام ملء الفضاء داخل عيوب الأنسجة. وأخيرا، نتائج المختبر في علم السموم عدة الفحص، 2،3-bis- (2-ميثوكسي-4-نيترو-5-sulfophenyl) -2H-نتروبلو-5-carboxanilide (XTT) ولايف / فحص قابلية الميت تشير إلى أن لاصق غير قادرة على دعم بقاء وانتشار مغلفة الكلى الجنينية البشرية (كلوة) 293 جملتعلمي اللغة اإلنكليزية أكثر من 5 أيام.
المواد الحيوية عن طريق الحقن هي تلك التي يمكن أن يتم تسليم مريح في الجسم كسائل وترسيخ في الموقع. وقد طبقت هذه المواد على نطاق واسع في الطب التجديدي، حيث يتم استخدامها لتوصيل الخلايا مغلفة لموقع المتضررين 1-4 ويكون بمثابة المصفوفة خارج الخلية مؤقتة ثلاثية الأبعاد للخلايا 5. بالنسبة للمريض، الحيوية عن طريق الحقن هي مفيدة لأن العمليات الجراحية لزرع هي الحد الأدنى الغازية والصلبة مرحلة يمكن ملء شكل غير منتظم عيوب الأنسجة، مما يلغي الحاجة لزراعة ذي الحجم المخصص.
Injectability لا يمكن أن يتحقق من خلال مجموعة متنوعة من الآليات. عوامل خارجية، مثل درجة الحموضة، وقد تم التحقيق بمثابة نقطة انطلاق لتشكيل المواد الهلامية التي تغلف الخلايا والجزيئات الحيوية النشطة 6-8. ومع ذلك، ودرجة الحموضة قد لا تكون على الزناد الأكثر ملائمة للاستخدام في جميع البيئات الفسيولوجية. ألترنا التقليدي آخرTIVE لتحقيق injectability يستخدم في الموقع البلمرة الكيميائية أو يشابك. وضعت مجموعة نظام الأكسدة القابلة للذوبان في الماء يتكون من فوق كبريتات الأمونيوم وN، N، N '، N' -tetramethylethylenediamine واستخدامها للتفاعل macromers يتكون من غليكول البولي إيثيلين والبولي (البروبيلين) غليكول 9،10. crosslinked زان وآخرون. 11 شبكات الشيتوزان البولي فينيل الكحول عن طريق الحقن المتقدمة مع غلوتارالدهيد. في مثل هذه الأنظمة، يجب النظر في السمية الخلوية من المكونات المتفاعلة، خاصة بالنسبة للتطبيقات التي تنطوي على تغليف الخلايا. أيضا، يمكن أن البلمرة الطاردة للحرارة ينتج درجة حرارة عالية كافية لتقديم تنازلات الأنسجة المحيطة، والتي تم الإبلاغ عن العظام البوليمر يعزز 12،13.
لا يزال تم وضع أنظمة البوليمر عن طريق الحقن الأخرى التي تظهر على التغيير من السائل إلى الحالة الصلبة مع درجة الحرارة كما الزناد. ما يسمى نظم thermogelling، وهذه هي aqueoلنا البوليمر الحلول التي لا تتطلب التحفيز الكيميائي، أحادية، أو crosslinkers لتحقيق في تشكيل الوضع الطبيعي 14. بدلا من ذلك، مرحلة انتقالية وعادة ما تحدث بالقرب درجة الحرارة الفسيولوجية الحث على تشكيل شبكة ثلاثية الأبعاد crosslinked جسديا. Poloxamers مثل Pluronic F127 هي من بين البوليمرات الأكثر دراسة على نطاق واسع لthermogelling تسليم المخدرات 15-17 وخلية التغليف 18،19. ومع ذلك، فمن المقبول تماما أن هذه المواد الهلامية تفتقر إلى الاستقرار في الظروف الفسيولوجية. وقد أظهرت الدراسات زيادة الاستقرار باستخدام موسعات سلسلة 20 أو crosslinkers الكيميائي 21،22. ومع ذلك، فإن استخدام هذه الكواشف قد تحد من إمكانات المواد لتغليف الخلايا.
بولي (N-isopropylacrylamide) هو thermogelling البوليمر الاصطناعية التي حظيت باهتمام كبير في هندسة الأنسجة والمخدرات تسليم 14. المحاليل المائية للبولي (N-isopropylacrylamide) (PNIPAAm) تبدي درجة حرارة المحلول أقل الحرجة (LCST)، وعادة ما تحدث في جميع أنحاء 32-34 درجة مئوية 23،24. تحت LCST والماء يرطب سلاسل PNIPAAm. فوق درجة حرارة التحول، البوليمر يصبح مسعور، مما أدى إلى مرحلة الفصل المثير 25-27 وتشكيل هلام الصلبة دون استخدام أحادية السامة أو crosslinkers. ومع ذلك، homopolymers PNIPAAm يحمل خصائص المرونة الفقيرة وعقد شرب القليل من الماء في درجة حرارة الفسيولوجية بسبب للا مائية 28. في هذا العمل، نختار لدمج سلفات تساهمي في شبكة PNIPAAm، والذي يوفر إمكانية التحلل الأنزيمي 29، والنشاط المضادة للالتهابات 30،31، وزيادة المياه وامتصاص العناصر الغذائية 32. تم إعداد بوليمرات PNIPAAm مع CS في مختبرنا من قبل البلمرة وNIPAAm مونومر بحضور-functionalized ميتاكريليت CS لتشكيل البوليمرات المطعمة (PNIPAAm-ز-CS). بيكause من منخفض الكثافة يشابك من البوليمرات، PNIPAAm-ز-CS يشكل حل لزجة في الماء عند RT وهلام مرونة في درجة حرارة الفسيولوجية بسبب LCST 29. تصبح الحلول البوليمر flowable مرة أخرى على تبريد تحت LCST بسبب انعكاس حالة من التحول.
لقد أثبتنا أن PNIPAAm-ز-CS لديه القدرة لتكون بمثابة سقالة هندسة الأنسجة، بسبب الخواص الميكانيكية التي يمكن أن تكون مصممة، التحلل، وcytocompatibility مع الكلى الجنينية البشرية (كلوة) 293 الخلايا 29. ومع ذلك، في بعض المناطق الحاملة، مثل القرص الفقري، يجب أن يكون السقالات هندسة الأنسجة القدرة على تشكيل واجهة كبيرة مع الأنسجة المحيطة القرص للقضاء على خطر التفكك 33. هذه الواجهة هي ضرورية أيضا لنقل كافية من القوة عبر واجهة بين الزرع والنسيج 33. في عملنا، ونحن قد علقتالمجهرية الدقيقة lginate في المحاليل المائية من PNIPAAm-ز-CS ووجدت أن دبق يموضع في المجهرية الدقيقة، والتي توفر التصاق مع الأنسجة المحيطة 34. في هذه الورقة، ونحن الخطوط العريضة الخطوات لإعداد thermogelling البوليمر لاصقة. تم تكييف التقنيات القياسية لتوصيف المواد الحيوية، التصوير الخلية، والمقايسات للبقاء على أن تأخذ في الاعتبار حساسية درجة حرارة من البوليمر والعودة إلى الوراء لمرحلة انتقالية. البوليمر عن طريق الحقن وصفها في هذه الورقة لديها امكانات واسعة لتسليم المخدرات وهندسة الأنسجة التطبيقات خارج تلك الموضحة في هذه الورقة. وعلاوة على ذلك، فإن أساليب توصيف الموصوفة هنا قد تكون قابلة للتطبيق لأنظمة thermogelling أخرى.
هناك العديد من الخطوات الهامة في توليف مركب هيدروجيل-microparticle وتقييم قوتها لاصقة، وتورم القدرة، وتوافق مع الحياة الخلوية. بلمرة الجذور الحرة من PNIPAAm-ز-CS تتطلب methacrylation ناجحة من سلفات، والحل الكامل للمكونات مونومر، وظروف التفاعل خالية من الأكسجين. وقد تم اختيار نسبة NIPAA…
The authors have nothing to disclose.
فإن الكتاب أن نعترف بامتنان المساعدة من الدكتورة جنيفر Kadlowec في تطوير لاصقة الشد اختبار البروتوكول.
وأيد البحث عنها في هذا المنشور من قبل المعهد الوطني لالتهاب المفاصل والعضلات والعظام والأمراض الجلدية والمعهد الوطني للتصوير الطبية الحيوية والهندسة الحيوية من المعاهد الوطنية للصحة تحت بجائزة عدد 1R15 AR 063920-01. المحتوى هو فقط من مسؤولية الكتاب ولا تمثل بالضرورة وجهة النظر الرسمية للمعاهد الوطنية للصحة.
N-isopropylacrylamide, 99%, pure, stabilized | Acros Organics | 2210-25-5 | Refrigerate and remove stabilier with hexane |
Chondroitin sulfate A sodium salt (from bovine trachea) | Sigma-Aldrich | 39455-18-0 | Refrigerate |
Hexanes | Fisher Scientific | H302-4 | Store in a flammable cabinet |
50% (w/w) sodium hydroxide | Fisher Scientific | SS254-1 | Caustic in nature |
Methacrylic anhydride | Sigma-Aldrich | 276685 | Strong fumes; use in a fume hood |
Acetone | Fisher Scientific | A18-4 | Chill in a refrigerator prior to use |
Nitrogen Gas | Praxair | 7727-37-9 | Part Number: NI 4.8, cylinder style T, 99.998% pure nitrogen (Argon may be used as an alternative inert gas) |
Tetramethylethylenediamine, 99% extra pure | Acros Organics | 110-18-9 | |
Ammonium persulfate | Sigma Aldrich | A3678 | Hygroscopic and degrades in the presence of water |
Phosphate buffered saline tablets | Fisher Scientific | BP2944 | Keep dry |
Alginic acid, sodium salt | Acros Organics | 177775000 | Use heat to aid in dissolving |
Calcium chloride dihydrate | Fisher Scientific | C79 | |
Canola oil | Local store | Obtain from a local store | |
Tween 20 | Sigma-Aldrich | 93773 | |
70% (v/v) Isopropoanol | Fisher Scientific | A416-4 | |
Porcine ears | Haine's Pork Shop | Obtain from a local butcher | |
Sodium Chloride | Fisher Scientific | S271-3 | |
Human embryonic kidney 293 cells | ATCC | ATCC CRL-1573 | Store in liquid nitrogen for long-term use |
DMEM: 1X, high glucose, no pyruvate | Life Technologies | 11965126 | Refrigerate |
Fetal bovine serum | Life Technologies | 10082-147 | Refrigerate |
Penn Strep: 10,000 U/ml | Life Technologies | 15140-122 | Refrigerate |
Trypsin-EDTA: 0.5%, 10X | Life Technologies | 15400-054 | Refrigerate |
Methanol | VWR | AAA44571-K7 | |
Live/Dead Cell viability kit | Life Technologies | L3224 | Light sensitive, keep frozen |
XTT cell viability kit | Sigma Aldrich | TOX2-1KT | Light sensitive, keep frozen |
Clear DMEM: 1X, high glucose, no phenol | Life Technologies | 21063-029 | Refrigerate |
Dulbecco's PBS: 1X | Life Technologies | 14190136 | Refrigerate |
Sodium citrate | EMD | SX0445-1 | |
Positive displacement pipette | BrandTech Scientific, INC | 2702904 | Dispenses 100 – 500 µL and comes with attachable tips |
No 3. Stainless Steel scalpel handle | Sigma Aldrich | S2896 | |
Miltex sterile surgical blades | Fisher Scientific | 12-460-440 | Size 10 |
Power gem homogenizer | Fisher Scientific | 08-451-660 | Model # 125 |
Porcelain mortar and pestle | Sigma Aldrich | Z247464 | Holds 50 mL |
FreeZone 1 L benchtop freeze dry system | Labconco | 7740020 | Freeze samples prior to use |
Oil sealed rotary vane pump | Edwards | A65301906 | Model # RV5 |
Incubating orbital shaker | VWR | 12620-946 | Model # 980153 |
Benchtop refrigerated centrifuge | Forma Scientific, INC | Model # 5682 | |
Heated ovens | VWR | Model # 1235PC | |
2 N force gauge | Shimpo | FGV-0.5XY | Model # FGV-0.5XY |
E-force test stand | Shimpo | FGS-200PV | Model # FGS-200PV |
Tissue culture swinging bucket centrifuge | Beckman Coulter | 366830 | Model #6S-6KR |
Tissue culture microcentrifuge | Eppendorf | Model #5415C | |
Hemacytometer set | Hausser Scientific | 3720 | Requires replacement cover glass slips |
Slide warmer | Lab Scientific | XH-2022 | Model # XH-2002 |
Portable heating lamp | Underwriters Laboratories | Helps to maintain polymer temperature at 37°C | |
Inverted fluorescent microscope | Zeiss | Model Axiovert 25 CFL | |
Heated water bath | VWR | Model # 1235PC | |
Rocking platform | VWR | Series 100 | |
Multiskan FC microtiter plate reader | Thermo Scientific | Type 357 | |
Cell culture incubator | VWR | Model # 2350T | |
Purifier class II biosafety cabinet | Labconco | Delta Series |