Injizierbare tissue engineering Gerüst aus Poly (N-isopropylacrylamid) -Pfropf-Chondroitinsulfat Mikroteilchen (PNIPAAm-g-CS) -haltigen Alginat besteht, wurde hergestellt. Die Haftfestigkeit, Quelleigenschaften und Biokompatibilität in vitro sind in dieser Studie untersucht. Die Charakterisierungstechniken hier entwickelt, können auf andere thermogelierende Systeme anwendbar sein.
Injizierbaren Biomaterialien als implantierbare Materialien definiert , die in den Körper als eine Flüssigkeit eingeführt werden kann und in situ verfestigt. Solche Materialien bieten die klinischen Vorteile der minimal-invasiv implantiert wird und leicht raumfüllende Feststoffe in unregelmäßig geformten Defekte bilden. Injizierbaren Biomaterialien wurden als Gerüste für Tissue Engineering umfassend untersucht. Jedoch für die Reparatur von bestimmten lasttragenden Bereiche im Körper, wie beispielsweise die Bandscheibe sollte Scaffolds Klebeigenschaften besitzen. Dadurch wird die Gefahr der Dislokation während der Bewegung zu minimieren und einen innigen Kontakt mit dem umgebenden Gewebe gewährleistet, eine ausreichende Kraftübertragung bereitstellt. Hier beschreiben wir die Herstellung und Charakterisierung eines Gerüstes, bestehend aus thermisch sensitive poly (N-Isopropylacrylamid) -Pfropf-Chondroitinsulfat (PNIPAAm-g-CS) und Alginat-Mikropartikel. Die PNIPAAm-g-CS-Copolymer bildet eine viskose Lösung in Wasser bei RT, in die alginate Partikel suspendiert Adhäsion zu verbessern. Oberhalb der unteren kritischen Lösungstemperatur (LCST), um die 30 ° C, bildet das Copolymer ein festes Gel um die Mikropartikel. Wir haben Standard Biomaterialien Charakterisierungsverfahren angepasst zu berücksichtigen, die reversible Phasenübergang von PNIPAAm-g-CS. Die Ergebnisse zeigen, dass der Einbau von 50 oder 75 mg / ml Alginat Partikel in 5% (w / v) PNIPAAm-g-CS-Lösungen die Haftzugfestigkeit von PNIPAAm-GCS allein (p <0,05) zu vervierfachen. Der Einbau von Alginat-Mikropartikel ebenfalls wesentlich erhöht Quellungsvermögen PNIPAAm-g-CS (p <0,05) und hilft, eine raumfüllende Gel innerhalb von Gewebedefekten zu halten. Schließlich Ergebnisse der in vitro – Toxikologie-Testkit, 2,3-bis- (2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl) -2H-tetrazolium-5-carboxanilid (XTT) und Live / Dead Lebensfähigkeitstest zeigen , dass die Klebstoff in der Lage ist, das Überleben und die Proliferation von verkapselten menschliche embryonale Nierenstütz (HEK) 293-cells über 5 Tage.
Injizierbaren Biomaterialien sind diejenigen , die bequem in den Körper als eine Flüssigkeit geliefert werden und in situ verfestigen. Solche Materialien wurden ausführlich in der regenerativen Medizin angewendet, wo sie für die Zellen 5 werden verwendet , um eingekapselten Zellen in das betroffene Seite 1-4 und wirken als dreidimensionale temporäre extrazellulären Matrix zu liefern. Für den Patienten sind injizierbare Biomaterialien vorteilhaft, weil die chirurgische Verfahren zur Implantation minimal invasiv sind und die feste Phase unregelmäßig Gewebedefekte zu füllen geformt, wodurch die Notwendigkeit für kundenspezifische Größe Implantate zu beseitigen.
Injizierbarkeit kann durch eine Vielzahl von Mechanismen erreicht werden. Externe Faktoren, wie pH – Wert, wurden als Auslöser für die Bildung von Gelen untersucht , die 6-8 – Zellen und bioaktiven Molekülen einzukapseln. Jedoch pH darf nicht die praktischste Trigger sein, alle physiologischen Umgebungen zu verwenden, bei. Ein weiteres traditionelles Alternative für Einspeiseleistung Erreichung der in situ chemische Polymerisation oder Vernetzung verwendet. Eine Gruppe entwickelt , die ein wasserlösliches Redoxsystem bestehend aus Ammoniumpersulfat und N, N, N ', N' N' – Tetramethylethylendiamin und verwendet sie für Makromere , bestehend aus Polyethylenglykol und Poly (propylen) glycol 9,10 reagiert. Zan et al. 11 entwickelten injizierbare Chitosan Polyvinylalkohols Netzwerke vernetzt mit Glutaraldehyd. In solchen Systemen muß die Zytotoxizität von reaktiven Komponenten in Betracht gezogen werden, insbesondere für Anwendungen, bei denen Zell Verkapselung. Auch könnte exotherme Polymerisation hoch genug Temperaturen erzeugen umgebende Gewebe zu beeinträchtigen, über die berichtet wurde , für polymere Knochenzemente 12,13.
Noch andere injizierbare Polymersysteme entwickelt worden, die einen Wechsel von der flüssigen in den festen Zustand mit der Temperatur als Auslöser aufweisen. Bekannt als thermogelierende Systeme, das sind aqueous Polymerlösungen , die in – situ – Bildung zu erzielen 14 keine chemischen Stimulus, Monomere oder Vernetzer erfordern. Vielmehr üblicherweise ein Phasenübergang in der Nähe von physiologischen Temperatur auftretenden induziert die Bildung eines physikalisch vernetzten dreidimensionalen Netzwerk. Poloxamere wie Pluronic F127 gehören zu den am häufigsten untersuchten Polymere für thermogelierenden Arzneimittelverabreichungs 15-17 und Zellverkapselung 18,19. Es ist jedoch allgemein anerkannt, dass diese Gele Stabilität bei physiologischen Bedingungen fehlen. Studien haben gezeigt , eine erhöhte Stabilität 21,22 mit Kettenverlängerungs 20 oder chemischen Vernetzer. Dennoch ist die Verwendung dieser Reagenzien kann das Potential der Materialien für die Verkapselung von Zellen begrenzen.
Poly (N-isopropylacrylamid) ist ein synthetisches thermogelierende Polymer , das 14 große Aufmerksamkeit im Tissue Engineering und Drug Delivery erhalten hat. Wässrige Lösungen von Poly (N-isopropylacrylamide) (PNIPAAm) zeigen eine untere kritische Lösungstemperatur (LCST), auftretende typischerweise etwa 32 bis 34 ° C 23,24. Unterhalb der LCST, Hydrate Wasser PNIPAAm Ketten. Oberhalb der Übergangstemperatur wird das Polymer hydrophob, was zu einer dramatischen Phasentrennung 25-27 und die Bildung eines festen Gels , ohne die Verwendung von toxischen Monomere oder Vernetzer. Jedoch zeigen PNIPAAm Homo elastischen Eigenschaften schlecht und wenig Wasser bei physiologischer Temperatur halten aufgrund der Hydrophobizität 28. In dieser Arbeit wählen wir Chondroitinsulfat kovalent in das PNIPAAm Netzwerk zu integrieren, die das Potenzial für die enzymatische Abbaubarkeit bietet 29, anti-inflammatorische Aktivität 30,31 und erhöhte Wasser- und Nährstoffaufnahme 32. PNIPAAm Copolymere mit CS wurden in unserem Labor hergestellt, indem das Monomer NIPAAm in Gegenwart von Methacrylat-funktionalisierten CS Polymerisieren gepfropfte Copolymer (PNIPAAm-g-CS) zu bilden. BecAUSE der geringen Vernetzungsdichte des Copolymers bildet PNIPAAm-g-CS eine viskose Lösung in Wasser bei RT und ein elastisches Gel bei physiologischer Temperatur aufgrund der LCST 29. Die Polymerlösungen werden erneut fließfähig auf unterhalb der LCST Abkühlung aufgrund der Reversibilität des Übergangs.
Wir haben gezeigt , dass PNIPAAm-g-CS das Potential hat als Tissue Engineering Gerüst zu dienen, aufgrund von mechanischen Eigenschaften , die angepasst werden können, Abbaubarkeit und cytocompatibility mit humanen embryonalen Niere (HEK) 293 – Zellen 29. Jedoch in bestimmten lasttragenden Bereichen, wie der Bandscheibe, Tissue Engineering Scaffolds sollte die Fähigkeit haben , eine wesentliche Schnittstelle mit umgebenden Scheibengewebe zu bilden , das Risiko einer Luxation 33 zu beseitigen. Diese Schnittstelle ist auch notwendig für die angemessene Kraftübertragung über die Grenzfläche zwischen dem Implantat und dem Gewebe 33. In unserer Arbeit haben wir ausgesetzt einlginate Mikropartikel in wässerigen Lösungen von PNIPAAm-g-CS und fanden , daß eine Gelierung der Mikropartikel lokalisiert, die mit 34 umgebendes Gewebe Adhäsion bereitzustellen. In diesem Papier beschreiben wir die Schritte zur Herstellung des thermogelierende, Klebstoffpolymer. Standardtechniken zur Charakterisierung von Biomaterialien, Cell Imaging und Assays für die Lebensfähigkeit wurden die Temperaturempfindlichkeit des Polymers und die Reversibilität der Phasenübergang zu berücksichtigen angepasst. Die injizierbare Polymer in diesem Papier beschrieben hat breite Potenzial für die Arzneimittelabgabe und Tissue-Engineering-Anwendungen außerhalb der in diesem Papier beschrieben. Außerdem hier beschriebenen Charakterisierungsmethoden können auf andere thermogelierende Systeme anwendbar sein.
Es gibt mehrere wichtige Schritte, um das Hydrogel-Mikropartikel-Composite bei der Synthese und seine Haftfestigkeit der Bewertung, Quellfähigkeit und zelluläre Biokompatibilität. Radikalische Polymerisation von PNIPAAm-g-CS erfordert eine erfolgreiche Methacrylierung von Chondroitinsulfat, eine vollständige Auflösung der Monomerkomponenten und sauerstofffreie Reaktionsbedingungen. Das Verhältnis von Monomer zu NIPAAm methacrylierte Chondroitinsulfat in dem Reaktionsgemisch wurde gewählt , weil es in unserer frü…
The authors have nothing to disclose.
Die Autoren möchten dankbar die Hilfe von Dr. Jennifer Kadlowec bei der Entwicklung des Protokolls Klebstoff Zugversuch bestätigen.
Forschung in dieser Veröffentlichung berichtet wurde durch das National Institute of Arthritis und Muskel-Skelett-und Hautkrankheiten und dem National Institute of Biomedical Imaging and Bioengineering der National Institutes of Health unter Verleihungsnummer 1R15 AR 063920-01 unterstützt. Der Inhalt ist allein in der Verantwortung der Autoren und stellen nicht notwendigerweise die offizielle Position der National Institutes of Health vertreten.
N-isopropylacrylamide, 99%, pure, stabilized | Acros Organics | 2210-25-5 | Refrigerate and remove stabilier with hexane |
Chondroitin sulfate A sodium salt (from bovine trachea) | Sigma-Aldrich | 39455-18-0 | Refrigerate |
Hexanes | Fisher Scientific | H302-4 | Store in a flammable cabinet |
50% (w/w) sodium hydroxide | Fisher Scientific | SS254-1 | Caustic in nature |
Methacrylic anhydride | Sigma-Aldrich | 276685 | Strong fumes; use in a fume hood |
Acetone | Fisher Scientific | A18-4 | Chill in a refrigerator prior to use |
Nitrogen Gas | Praxair | 7727-37-9 | Part Number: NI 4.8, cylinder style T, 99.998% pure nitrogen (Argon may be used as an alternative inert gas) |
Tetramethylethylenediamine, 99% extra pure | Acros Organics | 110-18-9 | |
Ammonium persulfate | Sigma Aldrich | A3678 | Hygroscopic and degrades in the presence of water |
Phosphate buffered saline tablets | Fisher Scientific | BP2944 | Keep dry |
Alginic acid, sodium salt | Acros Organics | 177775000 | Use heat to aid in dissolving |
Calcium chloride dihydrate | Fisher Scientific | C79 | |
Canola oil | Local store | Obtain from a local store | |
Tween 20 | Sigma-Aldrich | 93773 | |
70% (v/v) Isopropoanol | Fisher Scientific | A416-4 | |
Porcine ears | Haine's Pork Shop | Obtain from a local butcher | |
Sodium Chloride | Fisher Scientific | S271-3 | |
Human embryonic kidney 293 cells | ATCC | ATCC CRL-1573 | Store in liquid nitrogen for long-term use |
DMEM: 1X, high glucose, no pyruvate | Life Technologies | 11965126 | Refrigerate |
Fetal bovine serum | Life Technologies | 10082-147 | Refrigerate |
Penn Strep: 10,000 U/ml | Life Technologies | 15140-122 | Refrigerate |
Trypsin-EDTA: 0.5%, 10X | Life Technologies | 15400-054 | Refrigerate |
Methanol | VWR | AAA44571-K7 | |
Live/Dead Cell viability kit | Life Technologies | L3224 | Light sensitive, keep frozen |
XTT cell viability kit | Sigma Aldrich | TOX2-1KT | Light sensitive, keep frozen |
Clear DMEM: 1X, high glucose, no phenol | Life Technologies | 21063-029 | Refrigerate |
Dulbecco's PBS: 1X | Life Technologies | 14190136 | Refrigerate |
Sodium citrate | EMD | SX0445-1 | |
Positive displacement pipette | BrandTech Scientific, INC | 2702904 | Dispenses 100 – 500 µL and comes with attachable tips |
No 3. Stainless Steel scalpel handle | Sigma Aldrich | S2896 | |
Miltex sterile surgical blades | Fisher Scientific | 12-460-440 | Size 10 |
Power gem homogenizer | Fisher Scientific | 08-451-660 | Model # 125 |
Porcelain mortar and pestle | Sigma Aldrich | Z247464 | Holds 50 mL |
FreeZone 1 L benchtop freeze dry system | Labconco | 7740020 | Freeze samples prior to use |
Oil sealed rotary vane pump | Edwards | A65301906 | Model # RV5 |
Incubating orbital shaker | VWR | 12620-946 | Model # 980153 |
Benchtop refrigerated centrifuge | Forma Scientific, INC | Model # 5682 | |
Heated ovens | VWR | Model # 1235PC | |
2 N force gauge | Shimpo | FGV-0.5XY | Model # FGV-0.5XY |
E-force test stand | Shimpo | FGS-200PV | Model # FGS-200PV |
Tissue culture swinging bucket centrifuge | Beckman Coulter | 366830 | Model #6S-6KR |
Tissue culture microcentrifuge | Eppendorf | Model #5415C | |
Hemacytometer set | Hausser Scientific | 3720 | Requires replacement cover glass slips |
Slide warmer | Lab Scientific | XH-2022 | Model # XH-2002 |
Portable heating lamp | Underwriters Laboratories | Helps to maintain polymer temperature at 37°C | |
Inverted fluorescent microscope | Zeiss | Model Axiovert 25 CFL | |
Heated water bath | VWR | Model # 1235PC | |
Rocking platform | VWR | Series 100 | |
Multiskan FC microtiter plate reader | Thermo Scientific | Type 357 | |
Cell culture incubator | VWR | Model # 2350T | |
Purifier class II biosafety cabinet | Labconco | Delta Series |