एक इंजेक्शन ऊतक इंजीनियरिंग पाली (एन-isopropylacrylamide) -graft-chondroitin सल्फेट से बना पाड़ (PNIPAAm-G-सीएस) युक्त alginate microparticles तैयार किया गया था। चिपकने वाला शक्ति, गुण और इन विट्रो biocompatibility में सूजन इस अध्ययन में विश्लेषण कर रहे हैं। लक्षण वर्णन यहाँ विकसित तकनीकों अन्य thermogelling सिस्टम के लिए लागू हो सकता है।
इंजेक्शन biomaterials प्रत्यारोपण सामग्री है कि एक तरल के रूप में शरीर में पेश किया जा सकता है और बगल में जमना के रूप में परिभाषित कर रहे हैं। इस तरह की सामग्री प्रत्यारोपित किया जा रहा न्यूनतम invasively और आसानी से अनियमित आकार के दोष में अंतरिक्ष भरने ठोस बनाने के नैदानिक लाभ प्रदान करते हैं। इंजेक्शन biomaterials व्यापक रूप से ऊतक इंजीनियरिंग के लिए scaffolds के रूप में जांच की गई है। हालांकि, शरीर में कुछ लोड असर क्षेत्रों की मरम्मत के लिए, इस तरह के intervertebral डिस्क के रूप में, scaffolds चिपकने वाला गुण के अधिकारी चाहिए। इस प्रस्ताव के दौरान अव्यवस्था के जोखिम को कम करने और आसपास के ऊतकों के साथ घनिष्ठ संपर्क सुनिश्चित करेगा, बलों की पर्याप्त संचरण प्रदान करते हैं। यहाँ, हम तैयारी और thermally संवेदनशील पाली (एन-isopropylacrylamide) से बना एक पाड़ के लक्षण वर्णन -graft-chondroitin सल्फेट (PNIPAAM-G-सीएस) और alginate microparticles का वर्णन है। PNIPAAm-G-सीएस copolymer आरटी पर पानी में एक चिपचिपा समाधान है जो alginat में, रूपोंई कणों आसंजन बढ़ाने के लिए निलंबित कर दिया है। ऊपर कम महत्वपूर्ण समाधान तापमान (LCST), लगभग 30 डिग्री सेल्सियस, copolymer microparticles के चारों ओर एक ठोस जेल रूपों। हम मानक biomaterials लक्षण वर्णन प्रक्रियाओं ढाल लिया है खाते में PNIPAAm-G-सीएस की प्रतिवर्ती चरण संक्रमण लेने के लिए। परिणाम से संकेत मिलता है कि 5% में 50 या 75 मिलीग्राम / एमएल alginate कणों का समावेश (डब्ल्यू / वी) PNIPAAm-G-सीएस समाधान चौगुनी अकेले PNIPAAm-जेन्टलमैन के चिपकने वाला तन्य शक्ति (पी <0.05)। alginate microparticles के समावेश भी काफी PNIPAAm-G-सीएस की सूजन क्षमता (पी <0.05) बढ़ जाती है ऊतक दोषों के भीतर एक अंतरिक्ष भरने जेल बनाए रखने में मदद। अंत में, इन विट्रो विष विज्ञान परख किट, 2,3-bis- के परिणाम (2-methoxy-4-नाइट्रो-5-sulfophenyl) -2H-tetrazolium-5-carboxanilide (XTT) और लाइव / मृत व्यवहार्यता परख है कि संकेत मिलता है चिपकने वाला अस्तित्व और समझाया मानव भ्रूण गुर्दे के प्रसार समर्थन करने में सक्षम है (HEK) 293 ग5 दिनों में एल।
इंजेक्शन biomaterials उन है कि आसानी से एक तरल के रूप में शरीर में दिया जा सकता है और बगल में जमना कर रहे हैं। इस तरह की सामग्री पुनर्योजी चिकित्सा, जहां वे कोशिकाओं 5 के लिए एक तीन आयामी अस्थायी बाह्य मैट्रिक्स के रूप में प्रभावित साइट 1-4 और कार्य करने के लिए समझाया कोशिकाओं वितरित करने के लिए उपयोग किया जाता है में बड़े पैमाने पर लागू किया गया है। रोगी के लिए, इंजेक्शन biomaterials क्योंकि आरोपण के लिए शल्य चिकित्सा प्रक्रियाओं कम आक्रामक होते हैं और ठोस चरण अनियमित ऊतक दोषों के आकार भर सकते हैं, कस्टम आकार प्रत्यारोपण की आवश्यकता को समाप्त फायदेमंद हैं।
Injectability तंत्र की एक किस्म के माध्यम से प्राप्त किया जा सकता है। बाह्य कारकों, पीएच की तरह, जैल कि कोशिकाओं और बायोएक्टिव अणुओं 6-8 encapsulate के गठन के लिए एक ट्रिगर के रूप में जांच की गई है। हालांकि, पीएच सभी शारीरिक वातावरण में प्रयोग के लिए सबसे सुविधाजनक ट्रिगर नहीं हो सकता। एक और पारंपरिक ALTERNAinjectability को प्राप्त करने के लिए सक्रिय सीटू रासायनिक polymerization या तिर्यक में उपयोग कर रहा है। एक समूह ने एक पानी में घुलनशील redox अमोनियम persulfate और एन, एन, एन ',' एन -tetramethylethylenediamine की रचना की प्रणाली विकसित की है और पॉलीथीन ग्लाइकोल और पाली (प्रोपलीन) 9,10 ग्लाइकोल से बना macromers प्रतिक्रिया के लिए इसका इस्तेमाल किया। Zan एट अल। 11 विकसित इंजेक्शन chitosan polyvinylalcohol नेटवर्क glutaraldehyde साथ crosslinked। इस तरह की व्यवस्था में, प्रतिक्रियाशील घटकों के cytotoxicity, विशेष रूप से विचार किया जाना चाहिए सेल encapsulation जुड़े अनुप्रयोगों के लिए। इसके अलावा, एक्ज़ोथिर्मिक polymerization के आसपास के ऊतक, जिसके लिए बहुलक हड्डी सीमेंट्स 12,13 सूचित किया गया है समझौता करने के लिए पर्याप्त उच्च तापमान का उत्पादन कर सकता।
फिर भी अन्य इंजेक्शन बहुलक सिस्टम विकसित किया गया है कि ट्रिगर के रूप में तापमान के साथ ठोस राज्य के लिए तरल से एक परिवर्तन दिखा रहे हैं। thermogelling सिस्टम के रूप में जाना जाता है, इन aqueo हैंहमें बहुलक समाधान है कि रासायनिक उत्तेजना, monomers, या crosslinkers सीटू गठन के 14 में प्राप्त करने की आवश्यकता नहीं है। बल्कि, एक चरण संक्रमण आमतौर पर शारीरिक तापमान के पास होने वाली एक शारीरिक रूप से Crosslinked तीन आयामी नेटवर्क के गठन लाती है। ऐसे Pluronic F127 के रूप में Poloxamers दवा वितरण 15-17 और सेल encapsulation 18,19 thermogelling के लिए सबसे अधिक व्यापक रूप से अध्ययन पॉलिमर शामिल हैं। हालांकि, यह अच्छी तरह से स्वीकार किया है कि इन जैल शारीरिक स्थितियों में स्थिरता की कमी है। अध्ययन श्रृंखला extenders 20 या रासायनिक crosslinkers 21,22 का उपयोग कर वृद्धि की स्थिरता का प्रदर्शन किया है। फिर भी, इन अभिकर्मकों के उपयोग सेल encapsulation के लिए सामग्री की क्षमता को सीमित कर सकता।
पाली (एन isopropylacrylamide) एक सिंथेटिक बहुलक thermogelling कि ऊतक इंजीनियरिंग और दवा वितरण 14 में महत्वपूर्ण ध्यान दिया गया है। पाली के जलीय समाधान (एन isopropylacrylamide) (PNIPAAm), एक कम महत्वपूर्ण समाधान तापमान (LCST) का प्रदर्शन आम तौर पर 32 के आसपास होने वाली – 34 डिग्री सेल्सियस 23,24। LCST नीचे, पानी PNIPAAm चेन हाइड्रेट्स। ऊपर संक्रमण तापमान, बहुलक एक नाटकीय चरण जुदाई 25-27 और एक ठोस जेल के गठन विषाक्त monomers या crosslinkers के उपयोग के बिना, जिसके परिणामस्वरूप हाइड्रोफोबिक हो जाता है। हालांकि, PNIPAAm homopolymers गरीब लोचदार गुणों का प्रदर्शन और hydrophobicity 28 के कारण शारीरिक तापमान में थोड़ा पानी पकड़ो। इस काम में, हम chondroitin सल्फेट PNIPAAm नेटवर्क है, जो एंजाइमी degradability 29, विरोधी भड़काऊ गतिविधि 30,31, और वृद्धि पानी और पोषक तत्व अवशोषण 32 के लिए क्षमता प्रदान करता है में covalently शामिल करने के लिए चुनें। सीएस के साथ PNIPAAm copolymers हमारी प्रयोगशाला में methacrylate-क्रियाशील सीएस की उपस्थिति में मोनोमर NIPAAm polymerizing grafted copolymer (PNIPAAm-G-सीएस) के लिए फार्म द्वारा तैयार किए गए थे। Beccopolymer की कम crosslinking घनत्व की ause, PNIPAAm-G-सीएस LCST 29 के कारण आरटी पर पानी में एक चिपचिपा समाधान और शारीरिक तापमान पर एक इलास्टिक जेल रूपों। बहुलक समाधान संक्रमण के उलटने के कारण फिर से LCST नीचे ठंडा करने पर flowable हो जाते हैं।
हमने दिखा PNIPAAm-G-सीएस संभावित यांत्रिक गुणों कि सिलवाया जा सकता है, degradability, और मानव भ्रूण गुर्दे (HEK) के साथ cytocompatibility 293 कोशिकाओं 29 की वजह से, एक ऊतक इंजीनियरिंग पाड़ के रूप में कार्य करने के लिए है कि है। हालांकि, इस तरह intervertebral डिस्क के रूप में कुछ भार वहन क्षेत्रों में, ऊतक इंजीनियरिंग scaffolds अव्यवस्था 33 के खतरे को समाप्त करने के लिए आसपास के ऊतक डिस्क के साथ एक बड़ा इंटरफेस के रूप में करने की क्षमता होनी चाहिए। इस इंटरफ़ेस प्रत्यारोपण और ऊतक 33 के बीच इंटरफेस के पार बल की पर्याप्त प्रसारण के लिए भी आवश्यक है। हमारे काम में, हम एक निलंबित कर दिया हैPNIPAAm-G-सीएस के जलीय समाधान में lginate microparticles और पाया कि जमाना microparticles, जो ऊतकों 34 के आसपास के साथ आसंजन प्रदान localizes। इस पत्र में, हम thermogelling, चिपकने वाला बहुलक की तैयारी के लिए कदम रूपरेखा। व्यवहार्यता के लिए biomaterials लक्षण वर्णन, सेल इमेजिंग के लिए मानक तकनीक है, और assays के खाते में बहुलक का तापमान संवेदनशीलता और चरण संक्रमण के उलटने लेने के लिए अनुकूलित किया गया। इंजेक्शन बहुलक इस पत्र में वर्णित इस पत्र में वर्णित उन लोगों के बाहर दवा वितरण और ऊतक इंजीनियरिंग अनुप्रयोगों के लिए व्यापक संभावनाएं हैं। इसके अलावा, लक्षण यहाँ वर्णित विधि अन्य thermogelling सिस्टम के लिए लागू हो सकता है।
वहाँ हाइड्रोजेल-microparticle समग्र synthesizing और उसके चिपकने वाला शक्ति का मूल्यांकन, क्षमता है, और सेलुलर biocompatibility सूजन में कई महत्वपूर्ण कदम उठाए हैं। PNIPAAm-G-सीएस के नि: शुल्क कट्टरपंथी polymerization chondroitin सल्फेट के सफल methacrylation, मो…
The authors have nothing to disclose.
लेखकों कृतज्ञता चिपकने वाला तनन परीक्षण प्रोटोकॉल के विकास में डॉ जेनिफर Kadlowec की सहायता को स्वीकार करना होगा।
अनुसंधान इस प्रकाशन में सूचना दी गठिया और Musculoskeletal और त्वचा रोगों के राष्ट्रीय संस्थान और अवार्ड संख्या 1R15 एआर 063920-01 तहत बायोमेडिकल इमेजिंग और राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान के बायोइन्जिनियरिंग के राष्ट्रीय संस्थान द्वारा समर्थित किया गया। सामग्री केवल लेखकों की जिम्मेदारी है और जरूरी राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान के आधिकारिक विचार का प्रतिनिधित्व नहीं करता है।
N-isopropylacrylamide, 99%, pure, stabilized | Acros Organics | 2210-25-5 | Refrigerate and remove stabilier with hexane |
Chondroitin sulfate A sodium salt (from bovine trachea) | Sigma-Aldrich | 39455-18-0 | Refrigerate |
Hexanes | Fisher Scientific | H302-4 | Store in a flammable cabinet |
50% (w/w) sodium hydroxide | Fisher Scientific | SS254-1 | Caustic in nature |
Methacrylic anhydride | Sigma-Aldrich | 276685 | Strong fumes; use in a fume hood |
Acetone | Fisher Scientific | A18-4 | Chill in a refrigerator prior to use |
Nitrogen Gas | Praxair | 7727-37-9 | Part Number: NI 4.8, cylinder style T, 99.998% pure nitrogen (Argon may be used as an alternative inert gas) |
Tetramethylethylenediamine, 99% extra pure | Acros Organics | 110-18-9 | |
Ammonium persulfate | Sigma Aldrich | A3678 | Hygroscopic and degrades in the presence of water |
Phosphate buffered saline tablets | Fisher Scientific | BP2944 | Keep dry |
Alginic acid, sodium salt | Acros Organics | 177775000 | Use heat to aid in dissolving |
Calcium chloride dihydrate | Fisher Scientific | C79 | |
Canola oil | Local store | Obtain from a local store | |
Tween 20 | Sigma-Aldrich | 93773 | |
70% (v/v) Isopropoanol | Fisher Scientific | A416-4 | |
Porcine ears | Haine's Pork Shop | Obtain from a local butcher | |
Sodium Chloride | Fisher Scientific | S271-3 | |
Human embryonic kidney 293 cells | ATCC | ATCC CRL-1573 | Store in liquid nitrogen for long-term use |
DMEM: 1X, high glucose, no pyruvate | Life Technologies | 11965126 | Refrigerate |
Fetal bovine serum | Life Technologies | 10082-147 | Refrigerate |
Penn Strep: 10,000 U/ml | Life Technologies | 15140-122 | Refrigerate |
Trypsin-EDTA: 0.5%, 10X | Life Technologies | 15400-054 | Refrigerate |
Methanol | VWR | AAA44571-K7 | |
Live/Dead Cell viability kit | Life Technologies | L3224 | Light sensitive, keep frozen |
XTT cell viability kit | Sigma Aldrich | TOX2-1KT | Light sensitive, keep frozen |
Clear DMEM: 1X, high glucose, no phenol | Life Technologies | 21063-029 | Refrigerate |
Dulbecco's PBS: 1X | Life Technologies | 14190136 | Refrigerate |
Sodium citrate | EMD | SX0445-1 | |
Positive displacement pipette | BrandTech Scientific, INC | 2702904 | Dispenses 100 – 500 µL and comes with attachable tips |
No 3. Stainless Steel scalpel handle | Sigma Aldrich | S2896 | |
Miltex sterile surgical blades | Fisher Scientific | 12-460-440 | Size 10 |
Power gem homogenizer | Fisher Scientific | 08-451-660 | Model # 125 |
Porcelain mortar and pestle | Sigma Aldrich | Z247464 | Holds 50 mL |
FreeZone 1 L benchtop freeze dry system | Labconco | 7740020 | Freeze samples prior to use |
Oil sealed rotary vane pump | Edwards | A65301906 | Model # RV5 |
Incubating orbital shaker | VWR | 12620-946 | Model # 980153 |
Benchtop refrigerated centrifuge | Forma Scientific, INC | Model # 5682 | |
Heated ovens | VWR | Model # 1235PC | |
2 N force gauge | Shimpo | FGV-0.5XY | Model # FGV-0.5XY |
E-force test stand | Shimpo | FGS-200PV | Model # FGS-200PV |
Tissue culture swinging bucket centrifuge | Beckman Coulter | 366830 | Model #6S-6KR |
Tissue culture microcentrifuge | Eppendorf | Model #5415C | |
Hemacytometer set | Hausser Scientific | 3720 | Requires replacement cover glass slips |
Slide warmer | Lab Scientific | XH-2022 | Model # XH-2002 |
Portable heating lamp | Underwriters Laboratories | Helps to maintain polymer temperature at 37°C | |
Inverted fluorescent microscope | Zeiss | Model Axiovert 25 CFL | |
Heated water bath | VWR | Model # 1235PC | |
Rocking platform | VWR | Series 100 | |
Multiskan FC microtiter plate reader | Thermo Scientific | Type 357 | |
Cell culture incubator | VWR | Model # 2350T | |
Purifier class II biosafety cabinet | Labconco | Delta Series |