Syntese av Thermogelling Poly (N-isopropylakrylamid) -graft-chondroitin sulfate Composites med Alginat Mikropartikler for Tissue Engineering

Summary

En injeksjon tissue engineering stillaset består av poly (N-isopropylakrylamid) -graft-chondroitin sulfate (PNIPAAm-g-CS) holdige alginat mikropartikler ble utarbeidet. Den klebestyrke, svellende egenskaper og in vitro biologisk forenelighetsmiddel er analysert i denne studien. De karakterisering teknikker utviklet her kan være aktuelt for andre thermogelling systemer.

Abstract

Injiserbare biomaterialer er definert som implanterbare materialer som kan innføres i legemet som en væske og stivner in situ. Slike materialer vil gi de kliniske fordelene ved å være implantert minimal invasiv og lett danner plass fylle faste stoffer i uvanlig form defekter. Injiserbare biomaterialer har vært mye undersøkt som stillas for tissue engineering. Imidlertid, for reparasjon av enkelte belastningsbærende områder i kroppen, slik som intervertebral skive, stillaser bør ha adhesive egenskaper. Dette vil redusere faren for forvridning under bevegelse og sikre intim kontakt med det omkringliggende vev og gir tilfredsstillende overføring av krefter. Her beskriver vi utarbeidelse og karakterisering av et stillas som består av termisk følsom poly (N-isopropylakrylamid) -graft-chondroitin sulfate (PNIPAAM-g-CS) og alginat mikropartikler. Den PNIPAAm-g-CS-kopolymer danner en viskøs oppløsning i vann ved romtemperatur, inn i hvilken alginate partikler er suspendert for å forbedre vedheft. Over den nedre kritiske oppløsningstemperatur (LCST), rundt 30 ° C, danner kopolymeren en fast gel rundt mikropartiklene. Vi har tilpasset standard biomaterialer karakterisering prosedyrer for å ta hensyn til den reversible faseovergangen fra PNIPAAm-g-CS. Resultatene viser at inkorporering av 50 eller 75 mg / ml alginat partikler til 5% (w / v) PNIPAAm-g-CS løsninger firedoble den klebende strekkstyrke PNIPAAm-GCS alene (p <0,05). Inkorporering av alginat mikropartikler øker også vesentlig svelleevne av PNIPAAm-g-CS (p <0,05), bidrar til å opprettholde et romfyllende gel i løpet av vevsdefekter. Til slutt resultatene av in vitro analysesett toksikologi, 2,3-bis- (2-metoksy-4-nitro-5-sulfofenyl) -2H-tetrazolium-5-carboxanilide (XTT) og levende / døde levedyktighet analyse indikerer at limet er i stand til å støtte overlevelse og spredning av innkapslet humane embryonale nyre (HEK) 293 calen over 5 dager.

Introduction

Injiserbare biomaterialer er de som kan være beleilig avgis til kroppen som en væske og stivner in situ. Slike materialer har blitt brukt mye i regenerativ medisin, hvor de brukes til å levere innkapslede celler til det berørte området ^1-4 og fungere som et tredimensjonalt midlertidig ekstracellulære matrise for cellene ^5. For pasienten, injiserbare biomaterialer er en fordel fordi de kirurgiske prosedyrer for implantasjon er minimal invasiv og den faste fasen kan fylle uregelmessig formet vev defekter, eliminerer behovet for tilpasset størrelse implantater.

Injiserbarhet kan oppnås gjennom en rekke mekanismer. Eksterne faktorer som pH, har blitt undersøkt som en utløser for dannelsen av gels som innkapsler celler og bioaktive molekyler ^6-8. Men pH er kanskje ikke den mest praktiske trigger til å bruke i alle fysiologiske miljøer. En annen tradisjonell alternative for å oppnå injiserbarhet bruker in situ kjemisk polymerisering eller kryssbinding. En gruppe utviklet et vannoppløselig redokssystem bestående av ammonium persulfat og N, N, N ', N'-tetrametyletylendiamin og brukte den for omsetning av makromerer sammensatt av polyetylenglykol og poly (propylen) glykol ^9,10. Zan et al. ¹¹ utviklede injiserbare kitosan polyvinylalkohol nettverk tverrbundet med glutaraldehyd. I slike systemer må cytotoksisiteten av reaktive komponenter bli vurdert, spesielt for anvendelser som involverer celle innkapsling. Dessuten kan eksoterm polymerisasjon produsere høye nok temperaturer til å inngå kompromisser omkringliggende vev, som har blitt rapportert for polymerbeinsement ^12,13.

Ytterligere andre injiserbare polymersystemer har blitt utviklet som oppviser en endring fra flytende til fast tilstand med temperatur som avtrekkeren. Kjent som thermogelling systemer, disse er aqueooss polymeroppløsninger som ikke krever kjemisk stimulus, monomerer, eller tverrbindingsmidler for å oppnå in situ-dannelse ^14. Snarere en faseovergang som vanligvis oppstår i nærheten av fysiologisk temperatur induserer dannelsen av en fysisk kryssbundet tredimensjonalt nettverk. Poloksamerer slik som Pluronic F127 er blant de mest studerte polymerer for thermogelling medikamentavgivelse ^15-17 og celle innkapsling ^18,19. Det er imidlertid vel akseptert at disse gelene mangler stabilitet ved fysiologiske betingelser. Studier har vist økt stabilitet ved hjelp av kjedeforlengere ²⁰ eller kjemiske crosslinkers ^21,22. Ikke desto mindre, kan bruken av disse reagensene begrenser potensialet av materialet for celle innkapsling.

Poly (N-isopropylakrylamid) er et syntetisk thermogelling polymer som har fått betydelig oppmerksomhet i tissue engineering og levering av legemidler ^14. Vandige oppløsninger av poly (N-isopropylacrylamide) (PNIPAAm) viser en lavere kritisk løsning temperatur (LCST), er typisk rundt 32-34 ° C ^23,24. Under LCST, hydrater vann PNIPAAm kjeder. Over overgangstemperaturen, blir polymeren hydrofobe, noe som resulterer i en dramatisk faseseparasjon ^25-27 og dannelsen av en fast gel uten bruk av toksiske monomerer eller tverrbindere. Men PNIPAAm homo- utviser dårlige elastiske egenskaper og holde litt vann ved fysiologisk temperatur på grunn av hydrofobisitet ^28. I dette arbeidet, velger vi å innlemme chondroitin sulfate kovalent inn i PNIPAAm nettverk, som gir mulighet for enzymatisk nedbrytning ^29, anti-inflammatorisk aktivitet ^30,31, og økt vann- og næringsopptak ^32. PNIPAAm kopolymerer med CS ble fremstilt i vårt laboratorium ved å polymerisere monomeren NIPAAm i nærvær av metakrylat-funksjon CS under dannelse av podet kopolymer (PNIPAAm-g-CS). Because av lav tverrbindingstetthet av kopolymeren danner PNIPAAm-g-CS en viskøs løsning i vann ved RT og en elastisk gel ved fysiologisk temperatur på grunn av den LCST ^29. Polymeroppløsningene blir flytbar igjen ved avkjøling under LCST på grunn av reversibilitet av overgangen.

Vi har vist at PNIPAAm-g-CS har potensial til å fungere som en vevsteknologi stillaset, på grunn av mekaniske egenskaper som kan tilpasses, nedbrytbarhet, og cytocompatibility med humane embryonale nyre (HEK) 293-celler ^29. Men i visse belastningsbærende områder, slik som intervertebral platen, bør vevsteknologi stillaser har evnen til å danne en betydelig grensesnitt med omgivende vev skive for å eliminere faren for forvridning ^33. Dette grensesnittet er også nødvendig for tilfredsstillende overføring av kraft over grenseflaten mellom implantatet og vevet ^33. I vårt arbeid har vi suspendert enlginate mikropartikler i vandige oppløsninger av PNIPAAm-g-CS og funnet at gelering lokaliserer mikropartiklene, som gir adhesjon til omgivende vev ^34. I denne artikkelen vil vi skissere fremgangsmåten for utarbeidelse av thermogelling, klebende polymer. Standard teknikker for biomaterialer karakterisering, celle avbildning og analyser med hensyn på levedyktighet ble tilpasset for å ta hensyn til temperaturfølsomheten av polymeren, og den er reversibel faseovergangen. Den injiserbare polymer er beskrevet i denne artikkelen har bred potensial for levering av legemidler og ingeniør vev søknader utenom de som er beskrevet i denne artikkelen. Videre kan karakteriseringsmetoder som er beskrevet her være anvendelig for andre thermogelling systemer.

Protocol

1. Poly (N-isopropylakrylamid) -g-chondroitin sulfat Synthesis Forut for syntesen av den bioadhesive hydrogel, rense N-isopropylakrylamid (NIPAAm) monomer og -metakrylat chondroitinsulfat (CS). Vei ut minst 10 g NIPAAm og oppløse monomeren i 400 ml n-heksan ved 60 ° C. Omrør beholderen periodisk inntil fullstendig oppløsning. Omkrystalliser oppløsningen i en -20 ° C fryser i 24 timer. Fjern det krystalliserte monomeren fra beholderen og vakuum-filter n-heksan ved anvendelse av en Buch…

Representative Results

Et termisk reagerende podet ko-polymer ble med hell syntetisert og karakterisert for dets bioadhesiv styrke, svellende egenskaper, og in vitro cytocompatibility. Vi valgte å undersøke alginat grunn av sine veletablerte mukoadhesive egenskaper. Alginat mikropartikler, med en gjennomsnittlig diameter på 59,7 ± 14,9 nm, ble blandet med 5% (vekt / volum) PNIPAAm-g-CS i konsentrasjoner på 25, 50, og 75 mg / ml. Disse konsentrasjonene var basert på en-halv, lik, og to ganger den…

Discussion

Det er flere viktige skritt i å syntetisere den hydrogel-mikropartikkel kompositt og evaluere sin klebekraft, hevelse evne, og mobilnettet biokompatibilitet. Fri radikal polymerisasjon av PNIPAAm-g-CS krever vellykket methacrylation av chondroitinsulfat, fullstendig oppløsning av monomerkomponenter, og oksygenfrie reaksjonsbetingelser. Forholdet av monomer til NIPAAm methacrylated chondroitin sulfat i reaksjonsblandingen ble valgt fordi det er blitt vist, i vårt tidligere arbeid, for å danne kopolymerer med mekanisk…

Materials

N-isopropylacrylamide, 99%, pure, stabilized	Acros Organics	2210-25-5	Refrigerate and remove stabilier with hexane
Chondroitin sulfate A sodium salt (from bovine trachea)	Sigma-Aldrich	39455-18-0	Refrigerate
Hexanes	Fisher Scientific	H302-4	Store in a flammable cabinet
50% (w/w) sodium hydroxide	Fisher Scientific	SS254-1	Caustic in nature
Methacrylic anhydride	Sigma-Aldrich	276685	Strong fumes; use in a fume hood
Acetone	Fisher Scientific	A18-4	Chill in a refrigerator prior to use
Nitrogen Gas	Praxair	7727-37-9	Part Number: NI 4.8, cylinder style T, 99.998% pure nitrogen (Argon may be used as an alternative inert gas)
Tetramethylethylenediamine, 99% extra pure	Acros Organics	110-18-9
Ammonium persulfate	Sigma Aldrich	A3678	Hygroscopic and degrades in the presence of water
Phosphate buffered saline tablets	Fisher Scientific	BP2944	Keep dry
Alginic acid, sodium salt	Acros Organics	177775000	Use heat to aid in dissolving
Calcium chloride dihydrate	Fisher Scientific	C79
Canola oil	Local store		Obtain from a local store
Tween 20	Sigma-Aldrich	93773
70% (v/v) Isopropoanol	Fisher Scientific	A416-4
Porcine ears	Haine's Pork Shop		Obtain from a local butcher
Sodium Chloride	Fisher Scientific	S271-3
Human embryonic kidney 293 cells	ATCC	ATCC CRL-1573	Store in liquid nitrogen for long-term use
DMEM: 1X, high glucose, no pyruvate	Life Technologies	11965126	Refrigerate
Fetal bovine serum	Life Technologies	10082-147	Refrigerate
Penn Strep: 10,000 U/ml	Life Technologies	15140-122	Refrigerate
Trypsin-EDTA: 0.5%, 10X	Life Technologies	15400-054	Refrigerate
Methanol	VWR	AAA44571-K7
Live/Dead Cell viability kit	Life Technologies	L3224	Light sensitive, keep frozen
XTT cell viability kit	Sigma Aldrich	TOX2-1KT	Light sensitive, keep frozen
Clear DMEM: 1X, high glucose, no phenol	Life Technologies	21063-029	Refrigerate
Dulbecco's PBS: 1X	Life Technologies	14190136	Refrigerate
Sodium citrate	EMD	SX0445-1
Positive displacement pipette	BrandTech Scientific, INC	2702904	Dispenses 100 – 500 µL and comes with attachable tips
No 3. Stainless Steel scalpel handle	Sigma Aldrich	S2896
Miltex sterile surgical blades	Fisher Scientific	12-460-440	Size 10
Power gem homogenizer	Fisher Scientific	08-451-660	Model # 125
Porcelain mortar and pestle	Sigma Aldrich	Z247464	Holds 50 mL
FreeZone 1 L benchtop freeze dry system	Labconco	7740020	Freeze samples prior to use
Oil sealed rotary vane pump	Edwards	A65301906	Model # RV5
Incubating orbital shaker	VWR	12620-946	Model # 980153
Benchtop refrigerated centrifuge	Forma Scientific, INC		Model # 5682
Heated ovens	VWR		Model # 1235PC
2 N force gauge	Shimpo	FGV-0.5XY	Model # FGV-0.5XY
E-force test stand	Shimpo	FGS-200PV	Model # FGS-200PV
Tissue culture swinging bucket centrifuge	Beckman Coulter	366830	Model #6S-6KR
Tissue culture microcentrifuge	Eppendorf		Model #5415C
Hemacytometer set	Hausser Scientific	3720	Requires replacement cover glass slips
Slide warmer	Lab Scientific	XH-2022	Model # XH-2002
Portable heating lamp	Underwriters Laboratories		Helps to maintain polymer temperature at 37°C
Inverted fluorescent microscope	Zeiss		Model Axiovert 25 CFL
Heated water bath	VWR		Model # 1235PC
Rocking platform	VWR		Series 100
Multiskan FC microtiter plate reader	Thermo Scientific		Type 357
Cell culture incubator	VWR		Model # 2350T
Purifier class II biosafety cabinet	Labconco		Delta Series