I Vivo Functional Brain Imaging tilnærming basert på Bioluminescent Kalsium Indicator GFP-aequorin
Summary
Her presenterer vi en ny Ca 2+ -imaging tilnærming ved hjelp av en selvlysende reporter. Denne fremgangsmåten benytter et smeltet konstruksjon GFP-aequorin som binder til Ca2 + og sender ut lys, noe som eliminerer behovet for lett magnetisering. Betydelig denne metoden tillater lang sammenhengende bildebehandling, tilgang til dype strukturer i hjernen og høy tidsoppløsning.
Abstract
Funksjonell in vivo avbildning har blitt en kraftig tilnærming for å studere funksjonen og fysiologi av hjerneceller og strukturer av interesse. Nylig ble en ny metode for Ca 2+ -imaging bruker bioluminescent reporter GFP-aequorin (GA) har blitt utviklet. Denne nye teknikken bygger på blanding av de GFP og aequorin gener, produsere et molekyl som er i stand til å binde kalsium og – med tillegg av sin kofaktor coelenterazine – å sende ut lys som kan overvåkes via et foton samler. Transgene linjer som bærer GFP-aequorin genet er blitt generert for både mus og Drosophila. I Drosophila har GFP-aequorin genet er plassert under kontroll av en GAL4 / UAS binære uttrykk system som tillater målrettet ekspresjon og avbildning i hjernen. Metoden har senere blitt vist å være i stand til å detektere både innover Ca 2 + -transients og Ca 2+ -released fra indre butikker. Viktigst det åpner for en større varighet i kontinuerlig opptak, bildebehandling på større dyp i hjernen, og opptak ved høye time oppløsninger (opp til 8,3 ms). Her presenterer vi de grunnleggende metode for å bruke selvlysende bildebehandling for å registrere og analysere Ca 2+ -activity innenfor sopp organer, en struktur sentralt for læring og hukommelse i flue hjernen.
Introduction
Den grunnleggende mønster og funksjon av aktiviteten i hjernen og dens diskrete strukturer har lenge vært et område med intens studie innen nevro. Kanskje noen av de tidligste vellykkede tilnærminger brukes til å løse dette problemet var direkte fysiologiske målinger av endringen i elektrisk aktivitet – men alternative metoder som gjør at levende avbildning av endringer i spenning, pH eller kalsiumkonsentrasjoner (som proxy for aktivitet) har brakt flere evner til studiet av neuronal aktivitet en. Avbildningsteknikker har et bredt spekter av fordeler som redusert invasivitet og evnen til å registrere aktivitet i hele strukturer i hjernen. Videre i dyr med medgjørlig genetikk inkludert frukt fly Drosophila, utvikling av genetisk kodet kalsium indikatorer, som Cameleon, GCaMPs og andre en har tillatt forskere til å overvåke enkeltnerveceller, nevronale populasjoner og hele hjernenstrukturer. Mens mer tradisjonelle fluorescerende kalsiumavbildningsmetoder ved bruk av GCaMPs (GFP smeltet til calmodulin) eller FRET (CFP og YFP smeltet til calmodulin) har vist seg å være nyttige teknikker gir god romlig og tidsmessig oppløsning, den underliggende prosessen med lett magnetisering skaper noen begrensninger på sin eksperimentelle applikasjoner. På grunn av beskaffenheten av lys eksitasjon, autofluorescens, foto-bleking, og fototoksisitet er uunngåelig produsert, som dermed begrenser dybden av de strukturer som kan avbildes, varigheten av opptak, så vel som den virkelige tid kontinuiteten av opptaket. Med andre ord må opptak ofte utføres periodisk for å unngå disse uønskede bivirkninger.
På grunn av disse utfordringene, har flere alternative metoder for kalsium bildebehandling blitt utviklet. En av de mest lovende metodene er selvlysende avbildning, som er avhengig av lys som produseres gjennom en enzymatisk reaksjon etter kalsiumbindende. Bioluminescent bildebehandling krever ikke lys eksitasjon og dermed ikke opplever de samme problemene som vanlig kalsium bildebehandling. Bioluminescent reporter aequorin – isolert fra Aequorea victoria, det samme manet som GFP ble også isolert-binder kalsium via sine tre EF hånd strukturer og gjennomgår en konformasjonsendring, som fører til oksidasjon av sin kofaktor coelenterazine og utgivelsen av blått lys (λ = 469 nm) 2,3. Aequorin har en svært lav affinitet for kalsium (Kd = 10 pM) som gjør det ideelt for overvåking av kalsium transienter fordi det gir svært lite bakgrunnsstøy og ikke interfererer med den intracellulære kalsiumbuffersystem 4. Selv aequorin har tidligere blitt brukt til å overvåke prosessen med nevrale induksjon i Xenopus egg 5 lyset som produseres er for svak til å brukes for sanntids avbildning av neuronal aktivitet. I et forsøk på å møte denne utfordringen, Philippe Br &# 251; la og kolleger ved Pasteur Institute opprettet en genetisk konstruksjon fusing GFP og aequorin gener, etterligne naturlige tilstand innenfor maneter fire. Dette fusjons genprodukt binder kalsium igjen via de tre EF-hand strukturer av aequorin, som gjennomgår en konformasjonsendring som fører til oksidasjon av coelenterazine, som overfører energi ikke-strålings til GFP. Denne energien overføre resulterer i utslipp av grønt lys (λ = 509 nm) fra GFP, i stedet for blått lys fra aequorin. Sammensmeltingen av GFP og aequorin gir også større protein stabilitet hjelpe fusjonsproteinet produsere lys 19 til 65 ganger sterkere enn aequorin alene 4. Ved hjelp av en selvlysende tilnærming i hjernen utvider dagens eksperimentelle anvendelse av kalsium bildebehandling både når det gjelder varigheten av kontinuerlige opptak og antall strukturer i hjernen som kan tas opp. I store trekk i sammenheng med tidligere arbeid, betyr det at både globalt og en størrerekke regionalized "aktivitet" i hjernen kan overvåkes (gjennom proxy av kalsium transienter). Enda viktigere aktivitet kan overvåkes for lenger, i sanntid og kontinuerlig basis, som lett lar seg i jakten på en fullstendig forståelse av basal funksjon i hjernen.
I de siste årene har vår lab og andre utviklet transgene fluer uttrykker GFP-aequorin under kontroll av den binære uttrykk system (GAL4 / UAS-GFP-aequorin) 5,6. Vi har benyttet GFP-aequorin bioluminescens å registrere aktivitet produsert av naturlige stimuli som duft 7,8, samt studert de cellulære komponenter som modulerer Ca 2+ -activity i sopp organer følgende acetylcholin reseptor stimulering ved direkte påføring nikotin 9. I tillegg har vi også brukt GFP-aequorin å løse en rekke eksperimentelle spørsmål som ikke har vært i stand til å bli tatt opp tidligere, som langsiktigavbildning av spontane kalsium transienter og visualisering av dypere strukturer i hjernen 10. Mer nylig har vi brukt GAL4 / UAS system for å uttrykke pattedyr ATP reseptoren P2X to 11 et kation kanal, i projeksjons nevroner (PNS) og brukt Lexa systemet til å uttrykke GFP-aequorin i sjampinjong organer (MB247-Lexa, 13XLexAop2-IVS-G5A-BP) (a courtesy of B. Pfeiffer, Janelia Farm, USA). Dette har tillatt oss å aktivere PNS ved anvendelse av ATP, som i sin tur aktiverer de sopplegemene (et nedstrøms målet for PNS), etterligne flere naturforhold, slik som respons på en stimulus lukt. Totalt denne teknikken kombinerer P2X 2 og GFP-aequorin utvider de eksperimentelle muligheter. Grovt det gir mulighet for bedre å forstå mønstre av aktivitet i hjernen, initiere nye studier om hvordan ulike stimuli og forstyrrelser kan endre basal mønster av aktivitet.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den nylig utviklet bioluminescent-baserte GFP-aequorin tilnærming som presenteres her muliggjør in vivo funksjonelle opptak av Ca 2+ -activity i forskjellige neuroner, samt om ønsket, i andre slags celler slik som nyre stelceller som rapportert i Cabrero et al. 2013 5.
Modifikasjoner, feilsøking, tilleggskomponenter, og kritiske trinn
Drosophila Husbandry
<p class=…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We are indebted to E. Karplus, from Sciences Wares, USA, for his precious and useful help and advices. We thank E. Carbognin, A. Avet-Rochex, M. Murmu, P. Pavot, D. Minocci, G. Vinatier, and J. Stinnakre for their contribution to the development and improvement of this technique. We also thank B. Pfeiffer and G. Rubin, Janelia Farm, H.H.M.I., Ashburn, USA, for the pJFRC65-13XLexAop2-IVS-G5A-BP line. This work was supported by the Chateaubriand Fellowship, French Embassy, Washington, USA to A. Lark, by the National Science Foundation (IOS 1352882) to T. Kitamoto, and by the French ANRs (ANR-05-NEUR-009 Drosaequorin, 2005, and FlyBrainImaging, 2011), the Conseil Régional Ile-De France (NeRF and DIM), the IFR-144, the Physique-Chimie-Biologie Interface Program of the CNRS (2009), and by the CNRS, France to JR Martin.
Materials
| NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| CaCl2 | Merck | 1023911000 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | 7365-45-9 | |
| KCL | prolabo | 26 764.298 | normapur |
| MgCl | prolabo | 25 108.295 | normapur |
| sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| Nicotine | Sigma-Aldrich | N3876 | |
| ATP | Sigma-Aldrich | A2383 | Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate |
| benzyl-coelenterazine | Prolume, nanolight | Cat #301 Coelenterazine h | http://www.prolume.com/ |
| dental glue | 3M ESPE™ | 46954 | Protemp™ IV |
| silicon glue | 3M ESPE™ | 36958 | Express™ 2 Regular Body Quick |
| tape | 3M Scotch | 122s | 3M Scotch Magic Tape |
| pipette tips | Corning Incorporated | 4868 | 100-1000µL Univesal Pipette Tip |
| chamber and holder (stage) | N/A | N/A | hand made |
| incubation box | N/A | N/A | hand made |
| forceps (No 5) | Fine Science Tools | 11252-00 | Micro-dissecting forceps |
| curved forceps | Sigma-Aldrich | F4142 | Micro-dissecting forceps |
| glue applicator | N/A | N/A | hand made |
| knife | Fine Science Tools | 10316-14 | 5mm Depth 15° stab |
| EM-CCD camera | Andor | DU-897E-CS0-#BV | iXon (cooled to -80°C) |
| Microscope | Nikon | N/A | Eclipse-E800 |
| immersion objective lens | Nikon | N/A | 20x Fluor .5w |
| dissection microscope with fluorescence | Leica MZ Fl III | N/A | leica dissection scope and florescent lamp |
| tight dark box | Science Wares | N/A | Custom built by Science Wares |
| peristaltic pump | Gilson | N/A | Minipuls 2 |
| tubing | Fisher Scientific | depends on thickness | Tygon R3603, St-Gobain |
| perfusion system | Warner | 64-0135 (VC-66CS) | Perfusion valve control system, complete, with pinch valves, 6 channel |
| perfusion regulators | Leventon | 201108 | Dosi-flow 3 |
| measurement and automation explorer | Sciences Wares & National Instruments | N/A | software http://sine.ni.com/nips/cds/view/p/lang/en/nid/1380 |
| photon imager | Science Wares & National Instruments | N/A | software http://sine.ni.com/nips/cds/view/p/lang/en/nid/1380 |
| photon viewer | Science Wares & National Instuments | N/A | software http://sine.ni.com/nips/cds/view/p/lang/en/nid/1380 |
| Excel | Microsoft | N/A | software https://www.microsoft.com |
| virtual dub | open access | N/A | software http://virtualdub.sourceforge.net/ |
| UAS-GA2 | Martin et al., 2007, Ref. 1 | N/A | No stocks {currently} publicly available |
| pJFRC65-13XLexAop2-IVS-G5A-BP | B. Pfeiffer, Janelia Farms, Ashburn USA. | (STOCK #1117340) | pfeifferb@janelia.hhmi.org |
| P2X2 | Lima and Misenboeck, Ref. 11 | N/A | No stocks {currently} publicly available |
| OK107 | Bloomington stock center | 854 | http://flystocks.bio.indiana.edu/ |
References
- Martin, J. -. R. In vivo brain imaging: fluorescence or bioluminescence, which to choose. J Neurogenet. 22 (3), 285-307 (2008).
- Shimomura, O., Johnson, F. H. Peroxidized coelenterazine, the active group in the photoprotein aequorin. Proc Natl Acad Sci USA. 75 (6), 2611-2615 (1978).
- Shimomura, O., Johnson, F. H., Saiga, Y. Further data on the bioluminescent protein, aequorin. J. Cell. Comp. Physiol. 62 (1), 1-8 (1963).
- Baubet, V., et al. Chimeric green fluorescent protein-aequorin as bioluminescent Ca2+ reporters at the single-cell level. Proc Natl Acad Sci USA. 97 (13), 7260-7265 (2000).
- Cabrero, P., Richmond, L., Nitabach, M., Davies, S. A., Dow, J. A. T. A biogenic amine and a neuropeptide act identically: tyramine signals through calcium in Drosophila tubule stellate cells. Proc. Biol. Sci. 280 (1757), 20122943 (2013).
- Leclerc, C., Webb, S. E., Daguzan, C., Moreau, M., Miller, A. L. Imaging patterns of calcium transients during neural induction in Xenopus laevis embryos. J. Cell Sci. 113 (19), 3519-3529 (2000).
- Martin, J. -. R., Rogers, K. L., Chagneau, C., Brûlet, P. In vivo bioluminescence imaging of Ca2+ signalling in the brain of Drosophila. PLoS One. 2 (3), e275 (2007).
- Murmu, M. S., Stinnakre, J., Martin, J. -. R. Presynaptic Ca2+ stores contribute to odor-induced responses in Drosophila olfactory receptor neurons. J. Exp. Biol. 213 (24), 4163-4173 (2010).
- Murmu, M. S., Stinnakre, J., Réal, E., Martin, J. -. R. Calcium-stores mediate adaptation in axon terminals of Olfactory Receptor Neurons in Drosophila. BMC Neurosci. 12, 105 (2011).
- Pavot, P., Carbognin, E., Martin, J. -. R. PKA and cAMP/CNG channels independently regulate the cholinergic Ca2+-response of Drosophila mushroom body neurons. eNeuro. 2 (2), 0054-0068 (2015).
- Minocci, D., Carbognin, E., Murmu, M. S., Martin, J. -. R. In vivo functional calcium imaging of induced or spontaneous activity in the fly brain using a GFP-apoaequorin-based bioluminescent approach. BBA-Mol Cell Res. 1833 (7), 1632-1640 (2013).
- Lima, S. Q., Miesenböck, G. Remote control of behavior through genetically targeted photostimulation of neurons. Cell. 121 (1), 141-152 (2005).
- Shimomura, O., Musicki, B., Kishi, Y., Inouye, S. Light-emitting properties of recombinant semisynthetic aequorins and recombinant fluorescein-conjugated aequorin for measuring cellular calcium. Cell Calcium. 14 (5), 373-378 (1993).
- Berridge, M. J., Bootman, M. D., Roderick, H. L. Calcium signalling: dynamics, homeostasis and remodelling. Nat Rev Mol Cell Bio. 4 (7), 517-529 (2003).
- Fiala, A., Spall, T. In vivo calcium imaging of brain activity in Drosophila by transgenic cameleon expression. Sci STKE. 2003 (174), PL6 (2003).
- Wang, J. W., Wong, A. M., Flores, J., Vosshall, L. B., Axel, R. Two-photon calcium imaging reveals an odor-evoked map of activity in the fly brain. Cell. 112 (2), 271-282 (2003).
- Wilson, R. I., Turner, G. C., Laurent, G. Transformation of Olfactory Representations in the Drosophila Antennal Lobe. Science. 303 (5656), 366-370 (2004).
