एपिकार्डियल परिणाम संस्कृति परख और<em> पूर्व विवो</em> एपिकार्डियल व्युत्पन्न सेल प्रवास का आकलन
Summary
Here, we describe methods for isolating primary mouse epicardial cells by an outgrowth culture assay and assessing the functional migration of epicardial-derived cells (EPDC) using an ex vivo heart culture system. These protocols are suitable for identifying genetic and chemical modulators of epicardial epithelial-to-mesenchymal transition (EMT) and motility.
Abstract
epicardial कोशिकाओं लाइनों की एक एकल परत दिल, पैराक्राइन कारक है कि cardiomyocyte प्रसार को प्रोत्साहित प्रदान करने और सीधे विकास और बीमारी के दौरान हृदय progenitors योगदान दे। कारकों की एक संख्या epicardium व्युत्पन्न सेल (EPDC) जुटाने में फंसाया गया है, वहीं उनके बाद पलायन और भेदभाव गवर्निंग तंत्र खराब समझ रहे हैं। यहाँ, हम इन विट्रो और पूर्व vivo रणनीतियों में पेश EPDC गतिशीलता और भेदभाव का अध्ययन करने के लिए। सबसे पहले, हम भ्रूण माउस दिल से परिणाम संस्कृति से प्राथमिक epicardial कोशिकाओं को प्राप्त करने की एक विधि का वर्णन है। हम यह भी एक अंग संस्कृति प्रणाली में लेबल EPDC के तीन आयामी प्रवास का आकलन करने के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल का परिचय। हम इन तकनीकों है कि epicardium में myocardin से संबंधित प्रतिलेखन कारक के आनुवंशिक विलोपन attenuates EPDC माइग्रेशन का उपयोग सबूत प्रदान करते हैं। यह दृष्टिकोण EPDC के उम्मीदवार संशोधक का मूल्यांकन करने के लिए एक मंच के रूप में कार्य करता हैजीव विज्ञान और कहा कि हृदय की मरम्मत के लिए उपयोगी हो सकता है EPDC लामबंदी के उपन्यास नियामकों की पहचान करने के लिए आनुवंशिक या रासायनिक स्क्रीन विकसित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
Introduction
epicardium mesothelial कोशिकाओं की एक परत है कि लाइनों दिल और प्रभावों हृदय विकास, परिपक्वता और मरम्मत। पैराक्राइन संकेतों के एक अत्यधिक समन्वित विनिमय के माध्यम से, मायोकार्डियम और epicardium के बीच अंतरंग बातचीत हृदय वृद्धि और गैर-myocyte हृदय प्रजातियों 1 के गठन के लिए अपरिहार्य है। एपिकार्डियल व्युत्पन्न कोशिकाओं (EPDC) एक उपकला करने वाली mesenchymal संक्रमण (EMT) 2 के माध्यम से epicardial कोशिकाओं के एक सबसेट से उभरने, subepicardial अंतरिक्ष और अंतर्निहित मायोकार्डियम पर आक्रमण, और काफी हद तक कोरोनरी संवहनी भित्ति कोशिकाओं और हृदय fibroblasts में अंतर है, और एक को हद तक कम करने, endothelial कोशिकाओं और cardiomyocytes 3-9।
Epicardial EMT और EPDC आक्रमण के विनियमन तंत्र स्रावित ligands 10-13, कोशिका की सतह रिसेप्टर्स और आसंजन अणुओं 14,15, नियमित सहित विभिन्न अणुओं के समन्वित कार्रवाई करने के लिए जिम्मेदार ठहराया गया हैशिखर-बेसल polarity 16,17, छोटे GTPases 18,19, और प्रतिलेखन के विधायकों 2,20,21 कारकों। जबकि EPDC प्रवास के आणविक प्रभावोत्पादक के कई परिभाषित किया गया है, शारीरिक संकेत है कि भ्रूण में EPDC लामबंदी को प्रोत्साहित रणनीतियों के विकास में तेजी लाने सकता है की एक बेहतर समझ में सुधार हृदय की मरम्मत के लिए वयस्क में इस प्रक्रिया में हेरफेर करने के लिए।
EPDC लामबंदी के उपन्यास नियामकों की पहचान करने के उद्देश्य से अध्ययन इस सेल की आबादी की शुद्धि या व्यक्तिगत epicardial कोशिकाओं के प्रवास ट्रेसिंग पर भरोसा करते हैं। एक या WT1, Tcf21, Tbx18, और / या Aldh1a2 सहित मार्कर जीन, का एक संयोजन, सामान्यतः भ्रूण epicardium 1 की पहचान के लिए प्रयोग किया जाता है। हालांकि, इन मार्कर के उपयोग पलायन के रूप में epicardial मार्करों की अभिव्यक्ति दिल के विकास के पाठ्यक्रम पर क्षीण हो जाती है और अक्सर खो दिया है जब epicardial कोशिकाओं transdif गुजरना EPDC इष्टतम नहीं है ट्रैक करने के लिएmesenchymal कोशिकाओं में ferentiation।
Cre / loxP प्रणाली के आवेदन, वंश अनुरेखण पत्रकारों के साथ संयोजन के रूप में, स्थायी रूप से दिल के विकास के दौरान epicardium और उसके वंश लेबलिंग और वयस्क 7,22,23 में इस्कीमिक चोट के बाद में उपयोगी हो गया है। कई epicardial-प्रतिबंधित Cre लाइनों उत्पन्न किया गया है और व्यापक रूप से EPDC लेबल और सशर्त जीन विलोपन रणनीतियों 1 के लिए किया जाता है। इन अध्ययनों से विभिन्न epicardial प्रजातियों के लक्षण, और EPDC गतिशीलता और भेदभाव की आलोचना मध्यस्थों की पहचान करने के लिए नेतृत्व किया है। हालांकि, जमते सबूत भी पता चलता है epicardium पूर्वज कोशिकाओं 4,24,25 की एक विषम आबादी है। इस प्रकार, केवल epicardial कोशिकाओं के एक सबसेट एक दिया Cre ड्राइवर का उपयोग लक्षित किया जाएगा।
आदेश रचनात्मक विशिष्टता के बावजूद पूरे epicardium लेबल करने में, प्रयोगशालाओं की संख्या परिणाम संस्कृति का उपयोग किया हैसंरचना सिस्टम या पूर्व vivo अंग संस्कृति तरीकों ईमानदारी से अलग करने या मार्कर 26-28 एक आनुवंशिक वंश की अभिव्यक्ति के आधार पर बिना epicardial कोशिकाओं लेबल। पूर्व vivo प्रवास के अध्ययन के लिए, भ्रूण दिल epicardial EMT से पहले और एक हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) -expressing एडीनोवायरस (विज्ञापन / GFP) 9,18 के साथ पूरक माध्यम में सुसंस्कृत अलग कर रहे हैं। इस दृष्टिकोण के बजाय Cre की मध्यस्थता पुनर्संयोजन द्वारा कोशिकाओं के एक सबसेट पूरे epicardium के कुशल लेबलिंग के लिए अनुमति देता है। दिल संस्कृतियों बाद में EMT के नाम से जाना जाता inducers को उजागर कर रहे EPDC 28,29 की लामबंदी को प्रोत्साहित करने के लिए। पूर्व vivo और इन विवो विश्लेषण में इन विट्रो epicardial explant संस्कृतियों, जो EPDC प्रवास ड्राइविंग विस्तृत तंत्र की खोज के लिए एक विशेष रूप से उपयोगी तरीका है द्वारा पूरित कर रहे हैं।
यहाँ, हम epicardi की इन विट्रो अध्ययन के लिए प्राथमिक epicardial कोशिकाओं को अलग करने के लिए विधियों का वर्णनअल EMT, साथ ही पूर्व vivo के लिए एक अंग संस्कृति प्रणाली EPDC गतिशीलता का विश्लेषण करती है। हमने हाल ही में आनुवंशिक रूप से myocardin से संबंधित प्रतिलेखन कारक (MRTF) / सीरम प्रतिक्रिया कारक (एसआरएफ) अक्ष संकेत EPDC 9 के actin आधारित प्रवास हेरफेर करने के लिए नियमन द्वारा उपयोगिता और इस विधि की मजबूती का प्रदर्शन किया है। जबकि हमारे निष्कर्ष एक संकेतन मार्ग EPDC प्रवास को विनियमित करने के लिए आवश्यक प्रकाश डाला, इन तरीकों तंत्र है कि सामूहिक रूप से EPDC प्रवास और भेदभाव आर्केस्ट्रा unraveling के लिए उपयुक्त हैं। इसके अलावा, explant और पूर्व vivo संस्कृति प्रणालियों हृदय उत्थान में चिकित्सीय अनुप्रयोगों के लिए EPDC लामबंदी के उपन्यास नियामकों की पहचान करने के लिए कार्यात्मक स्क्रीन में लागू किया जा सकता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
यहाँ हम विस्तृत तरीके रूपरेखा परिणाम द्वारा प्राथमिक epicardial सेल को अलग और पूर्व vivo दिल संस्कृतियों में EPDC प्रवास को ट्रैक करने के लिए। परिणाम संस्कृतियों के लिए, epicardium समाप्त दिल को दूर करने के लिए उचित ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ईएमएस स्वास्थ्य (एनआईएच) के राष्ट्रीय संस्थानों से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था [अनुदान संख्या R01HL120919]; अमेरिकन हार्ट एसोसिएशन [अनुदान संख्या 10SDG4350046]; एनआईएच [अनुदान संख्या UL1 TR000042] से रोचेस्टर सीटीएसए पुरस्कार के विश्वविद्यालय, और Aab CVRI से स्टार्टअप धन। मेट हॉवर्ड ह्यूजेस मेडिकल इंस्टीट्यूट मेड-में-ग्रैड पहल से चिकित्सा और दंत चिकित्सा के रोचेस्टर विश्वविद्यालय के स्कूल ऑफ करने के लिए एक अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था; और एनआईएच [अनुदान संख्या GM068411] से एक संस्थागत रुथ एल Kirschstein राष्ट्रीय अनुसंधान सेवा पुरस्कार।
Materials
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Hyclone | SH3002201 | DMEM |
| Hanks' Balanced Salt Solution | Hyclone | SH3003102 | HBSS |
| Medium 199 | Hyclone | SH3025301 | M199 |
| Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline | Hyclone | SH3002802 | DPBS |
| Fetal Bovine Serum | Gemini | 100-106 | FBS |
| Penicillin/Streptomycin Solution | Hyclone | SV30010 | |
| Corning Biocoat Collagen I, 4-Well Culture Slides | Corning | 354557 | |
| Multiwell 24-well plates | Falcon | 08-772-1 | |
| Dissecting microscope | Leica | M50 | Equipped with Leica KL300 LED might source |
| Confocal miscroscope | Olympus | 1X81 | Equipped with muli-argon laser 405/488/515, FV10-MCPSU laser 405/440/635, 559 laser, and mercury lamp |
| Bioruptor | Diagenode | UCD-200 | |
| Transforming growth factor beta 1 | R&D Systems | 100-B-001 | TGF-β1 |
| Platelet-derived growth factor BB | R&D Systems | 220-BB-010 | PDGF-BB |
| Trizol Reagent | Applied Biosystems | 15596-026 | Caution, hazardous material |
| TURBO DNA-free Kit | Life Technologies | AM1907 | DNaseI |
| iScript cDNA Synthesis Kit | BioRad | 1708891 | |
| UltraPure Glycogen | Life Technologies | 10814-010 | |
| SYBR Green | BioRad | 170-8880 | |
| Protease inhibtor cocktail tablets | Roche | 11836170001 | |
| Alexa Goat-anti-rabbit 488 | Life Technologies | A11008 | Secondary antibody |
| Alexa Goat anti-rabbit 594 | Life Technologies | A-11012 | Secondary antibody |
| Alexa Goat anti-mouse 594 | Life Technologies | A-11005 | Secondary antibody |
| Mouse anti-smooth muscle alpha actin, Cy3-conjugated | Sigma-Aldrich | C6198 | monoclonal antibody, clone 1A4 |
| Mouse anti-Wilms tumor 1 (WT1) | Life Technologies | MA1-46028 | monoclonal antibody, clone 6F-H2 |
| Rabbit anti-ZO1 | Life Technologies | 40-2200 | polyclonal antibody |
| Rabbit anti-Collagen Type 4 | Millipore | AB756P | polyclonal antibody |
| 4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride | Life Technologies | D1306 | DAPI |
| Fluorescent mounting medium | DAKO | S3023 | |
| 16% Paraformaldehyde solution | Electron Microscopy Sciences | 15710 | PFA diluted to 4% in DPBS. Caution, hazardous material |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| Tissue Freezing Medium | Triangle Biomedical Sciences | TFM-B | |
| Pap pen | DAKO | S2002 | |
| Disposable mictrotome blades | Sakura Finetek | 4689 | |
| Microscope slides | Globe Scientific | 1358W | positively charged, 25 x 75 x 1mm |
| Cryostat | Leica | CM1950 | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11295-00 | |
| Surgical Scissors | Fine Science Tools | 91460-11 | |
| Disposable base molds | Fisher Scientific | 22-363-553 | |
| Ketamine | Hospira | NDC 0409-2051-05 | |
| Xylazine | Akorn | NADA 139-236 |
References
- von Gise, A., Pu, W. T. Endocardial and epicardial epithelial to mesenchymal transitions in heart development and disease. Circ Res. 110, 1628-1645 (2012).
- Martinez-Estrada, O. M., et al. Wt1 is required for cardiovascular progenitor cell formation through transcriptional control of Snail and E-cadherin. Nat Genet. 42, 89-93 (2010).
- Gittenberger-de Groot, A. C., Vrancken Peeters, M. P., Mentink, M. M., Gourdie, R. G., Poelmann, R. E. Epicardium-derived cells contribute a novel population to the myocardial wall and the atrioventricular cushions. Circ Res. 82, 1043-1052 (1998).
- Katz, T. C., et al. Distinct compartments of the proepicardial organ give rise to coronary vascular endothelial cells. Dev Cell. 22, 639-650 (2012).
- Mikawa, T., Gourdie, R. G. Pericardial mesoderm generates a population of coronary smooth muscle cells migrating into the heart along with ingrowth of the epicardial organ. Dev Biol. 174, 221-232 (1996).
- Wilm, B., Ipenberg, A., Hastie, N. D., Burch, J. B., Bader, D. M. The serosal mesothelium is a major source of smooth muscle cells of the gut vasculature. Development. 132, 5317-5328 (2005).
- Zhou, B., et al. Epicardial progenitors contribute to the cardiomyocyte lineage in the developing heart. Nature. 454, 109-113 (2008).
- Dettman, R. W., Denetclaw, W., Ordahl, C. P., Bristow, J. Common epicardial origin of coronary vascular smooth muscle, perivascular fibroblasts, and intermyocardial fibroblasts in the avian heart. Dev Biol. 193, 169-181 (1998).
- Trembley, M. A., Velasquez, L. S., de Mesy Bentley, K. L., Small, E. M. Myocardin-related transcription factors control the motility of epicardium-derived cells and the maturation of coronary vessels. Development. 142, 21-30 (2015).
- Mellgren, A. M., et al. Platelet-derived growth factor receptor beta signaling is required for efficient epicardial cell migration and development of two distinct coronary vascular smooth muscle cell populations. Circ Res. 103, 1393-1401 (2008).
- von Gise, A., et al. WT1 regulates epicardial epithelial to mesenchymal transition through beta-catenin and retinoic acid signaling pathways. Dev Biol. 356, 421-431 (2011).
- Lavine, K. J., et al. Endocardial and Epicardial Derived FGF Signals Regulate Myocardial Proliferation and Differentiation In Vivo. Dev Cell. 8, 85-95 (2005).
- Sanchez, N. S., Barnett, J. V. TGFbeta and BMP-2 regulate epicardial cell invasion via TGFbetaR3 activation of the Par6/Smurf1/RhoA pathway. Cell Signal. 24, 539-548 (2012).
- Dettman, R. W., Pae, S. H., Morabito, C., Bristow, J. Inhibition of 4-integrin stimulates epicardial-mesenchymal transformation and alters migration and cell fate of epicardially derived mesenchyme. Dev Biol. 257, 315-328 (2003).
- Rhee, D. Y., et al. Connexin 43 regulates epicardial cell polarity and migration in coronary vascular development. Development. 136, 3185-3193 (2009).
- Wu, M., et al. Epicardial spindle orientation controls cell entry into the myocardium. Dev Cell. 19, 114-125 (2010).
- Hirose, T., et al. PAR3 is essential for cyst-mediated epicardial development by establishing apical cortical domains. Development. 133, 1389-1398 (2006).
- Baek, S. T., Tallquist, M. D. Nf1 limits epicardial derivative expansion by regulating epithelial to mesenchymal transition and proliferation. Development. 139, 2040-2049 (2012).
- Lu, J., et al. Coronary smooth muscle differentiation from proepicardial cells requires rhoA-mediated actin reorganization and p160 rho-kinase activity. Dev Biol. 240, 404-418 (2001).
- Combs, M. D., Braitsch, C. M., Lange, A. W., James, J. F., Yutzey, K. E. NFATC1 promotes epicardium-derived cell invasion into myocardium. Development. 138, 1747-1757 (2011).
- Acharya, A., et al. The bHLH transcription factor Tcf21 is required for lineage-specific EMT of cardiac fibroblast progenitors. Development. 139, 2139-2149 (2012).
- Zhou, B., von Gise, A., Ma, Q., Hu, Y. W., Pu, W. T. Genetic fate mapping demonstrates contribution of epicardium-derived cells to the annulus fibrosis of the mammalian heart. Dev Biol. 338, 251-261 (2010).
- Zhou, B., et al. Adult mouse epicardium modulates myocardial injury by secreting paracrine factors. J Clin Invest. 121, 1894-1904 (2011).
- Singh, M., Epstein, J. Epicardial Lineages and Cardiac Repair. Journal of Developmental Biology. 1, 141-158 (2013).
- Braitsch, C. M., Combs, M. D., Quaggin, S. E., Yutzey, K. E. Pod1/Tcf21 is regulated by retinoic acid signaling and inhibits differentiation of epicardium-derived cells into smooth muscle in the developing heart. Dev Biol. 368, 345-357 (2012).
- Austin, A. F., Compton, L. A., Love, J. D., Brown, C. B., Barnett, J. V. Primary and immortalized mouse epicardial cells undergo differentiation in response to TGFbeta. Developmental dynamics : an official publication of the American Association of Anatomists. 237, 366-376 (2008).
- Kim, J., Rubin, N., Huang, Y., Tuan, T. L., Lien, C. L. In vitro culture of epicardial cells from adult zebrafish heart on a fibrin matrix. Nat Protoc. 7, 247-255 (2012).
- Compton, L. A., Potash, D. A., Mundell, N. A., Barnett, J. V. Transforming growth factor-beta induces loss of epithelial character and smooth muscle cell differentiation in epicardial cells. Developmental dynamics : an official publication of the American Association of Anatomists. 235, 82-93 (2006).
- Smith, C. L., Baek, S. T., Sung, C. Y., Tallquist, M. D. Epicardial-derived cell epithelial-to-mesenchymal transition and fate specification require PDGF receptor signaling. Circ Res. 108, 15-26 (2011).
- Shea, K., Geijsen, N. Dissection of 6.5 dpc Mouse Embryos. JOVE. 2, (2007).
- Witty, A. D., et al. Generation of the epicardial lineage from human pluripotent stem cells. Nature biotechnology. 32, 1026-1035 (2014).
- Iyer, D., et al. Robust derivation of epicardium and its differentiated smooth muscle cell progeny from human pluripotent stem cells. Development. 142, 1528-1541 (2015).
- Takeichi, M., Nimura, K., Mori, M., Nakagami, H., Kaneda, Y. The transcription factors Tbx18 and Wt1 control the epicardial epithelial-mesenchymal transition through bi-directional regulation of Slug in murine primary epicardial cells. PloS one. 8, e57829 (2013).
- Wong, M. L., Medrano, J. F. Real-time PCR for mRNA quantitation. BioTechniques. 39, 75-85 (2005).
- Schmittgen, T. D., Livak, K. J. Analyzing real-time PCR data by the comparative CT method. Nature Protocols. 3, 1101-1108 (2008).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical biochemistry. 72, 248-254 (1976).
- Moore, A. W., McInnes, L., Kreidberg, J., Hastie, N. D., Schedl, A. YAC complementation shows a requirement for Wt1 in the development of epicardium, adrenal gland and throughout nephrogenesis. Development. 126, 1845-1857 (1999).
- Kim, J., et al. PDGF signaling is required for epicardial function and blood vessel formation in regenerating zebrafish hearts. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 17206-17210 (2010).
- Kalluri, R., Weinberg, R. A. The basics of epithelial-mesenchymal transition. J Clin Invest. 119, 1420-1428 (2009).
- Dong, X. R., Maguire, C. T., Wu, S. P., Majesky, M. W. Chapter 9 Development of Coronary Vessels. Methods in Enzymology. 445, 209-228 (2008).
- Ruiz-Villalba, A., Ziogas, A., Ehrbar, M., Perez-Pomares, J. M. Characterization of epicardial-derived cardiac interstitial cells: differentiation and mobilization of heart fibroblast progenitors. PLoS One. 8, e53694 (2013).
- Garriock, R. J., Mikawa, T., Yamaguchi, T. P. Isolation and culture of mouse proepicardium using serum-free conditions. Methods. 66, 365-369 (2014).
- Smart, N., Riley, P. Derivation of epicardium-derived progenitor cells (EPDCs) from adult epicardium. Curr Protoc Stem Cell Biol. , (2009).
- Zhou, B., Pu, W. T. Isolation and characterization of embryonic and adult epicardium and epicardium-derived cells. Methods Mol Biol. 843, 155-168 (2012).
- Morabito, C. J., Dettman, R. W., Kattan, J., Collier, J. M., Bristow, J. Positive and negative regulation of epicardial-mesenchymal transformation during avian heart development. Dev Biol. 234, 204-215 (2001).
- Grieskamp, T., Rudat, C., Ludtke, T. H., Norden, J., Kispert, A. Notch signaling regulates smooth muscle differentiation of epicardium-derived cells. Circ Res. 108, 813-823 (2011).
