Epikardiale Outgrowth Kulturtest und<em> Ex Vivo</em> Beurteilung von Epikardiale abgeleiteten Zellmigration
Summary
Here, we describe methods for isolating primary mouse epicardial cells by an outgrowth culture assay and assessing the functional migration of epicardial-derived cells (EPDC) using an ex vivo heart culture system. These protocols are suitable for identifying genetic and chemical modulators of epicardial epithelial-to-mesenchymal transition (EMT) and motility.
Abstract
Eine einzelne Schicht aus epikardialen Zelllinien das Herz, parakrine Faktoren, die die Bereitstellung von Kardiomyozyten Proliferation stimulieren und Herz-Kreislauf-Vorläufern während der Entwicklung und Krankheit direkt beitragen. Während eine Anzahl von Faktoren in Epikard abgeleitete Zelle (EPDC) Mobilisierungs gebracht wurde, werden die Mechanismen ihrer späteren Migration und Differenzierung regeln schlecht verstanden. Hier stellen wir in vitro und ex vivo – Strategien EPDC Motilität und Differenzierung zu studieren. Zunächst beschreiben wir ein Verfahren zur primären epikardialen Zellen durch Auswachsen aus der Kultur embryonaler Mäuseherzen erhalten. Außerdem stellen wir ein detailliertes Protokoll dreidimensionale Migration von markierten EPDC in einem Organkultursystem zu bewerten. Wir bieten Beweise für diese Techniken, die genetische Deletion von myocardin bezogenen Transkriptionsfaktoren im Epikard EPDC Migration abschwächt. Dieser Ansatz dient als Plattform Kandidat Modifikatoren der EPDC zu bewertenBiologie und könnte verwendet werden, genetische oder chemische Bildschirme zu entwickeln neuartigen Regulatoren der EPDC Mobilisierung zu identifizieren, die für die Herzreparatur nützlich sein könnten.
Introduction
Das Epikard ist eine einzelne Schicht aus Mesothelzellen, die Linien das Herz und die Auswirkungen Herz Entwicklung, Reifung und Reparatur. Durch eine hoch koordinierten Austausch von parakrine Signale ist die innige Dialog zwischen dem Myokard und Epikard unverzichtbar für kardiale Wachstum und der Bildung von Nicht-Myozyten – Herzabstammungslinien 1. Epikardiale abgeleiteten Zellen (EPDC) ergeben sich aus einer Untergruppe von epikardialen Zellen durch eine epitheliale zu mesenchymale Transition (EMT) 2, dringen in den subepikardialen Raum und das darunter liegende Myokard und unterscheiden weitgehend in koronaren Gefäßwandzellen und kardialen Fibroblasten, und ein geringerem Maße, Endothelzellen und Kardiomyozyten 3-9.
Die Regulierungsmechanismen epikardialen EMT und EPDC Invasion haben die koordinierte Aktion verschiedener Moleküle einschließlich sezerniert Liganden 10-13, Zelloberflächenrezeptoren und Adhäsionsmoleküle 14,15, regel zugeschrieben wordenToren der apikal-basale Polarität 16,17, kleine GTPasen 18,19 und Transkriptionsfaktoren 2,20,21. Während viele der molekularen Effektoren der EPDC Migration definiert wurden, ein besseres Verständnis der physiologischen Signale, die EPDC Mobilisierung im Embryo stimulieren kann die Entwicklung von Strategien beschleunigen diesen Prozess bei Erwachsenen für eine verbesserte Herz-Reparatur zu manipulieren.
Ziel Studien neue Regulatoren der EPDC Mobilisierung zu identifizieren, verlassen sich auf die Reinigung von dieser Zellpopulation oder die Migration einzelner epikardialen Zellen zu verfolgen. Eine oder eine Kombination von Markergenen, einschließlich Wt1, Tcf21, Tbx18 und / oder Aldh1a2, wird üblicherweise um die fötale Epikard 1 zu identifizieren. die Verwendung dieser Marker jedoch zu verfolgen EPDC Migration nicht optimal ist, als Ausdruck der epikardialen Markierungen im Laufe der Herzentwicklung nachlässt und wird oft verloren, wenn epikardialen Zellen transdif laufenferenzierung in mesenchymalen Zellen.
Die Anwendung des Cre / loxP – System in Verbindung mit lineage-Tracing – Reporter wurde in permanent Markierung des Epikard und seine Abkömmlinge während Herzentwicklung und nach ischämischer Verletzung im erwachsenen 7,22,23 nützlich. Mehrere epikardialen beschränkten Cre Linien wurden 1 erzeugt und verwendet werden , weit EPDC und für die bedingte Gen – Deletion Strategien zu beschriften. Diese Studien haben die Charakterisierung verschiedener Abstammungen epikardialen geführt, und die Identifizierung von kritischen Mediatoren von EPDC Motilität und Differenzierung. Allerdings akkumulieren Hinweise darauf , auch die Epikard eine heterogene Population von Vorläuferzellen 4,24,25 ist. Somit wird nur eine Teilmenge von epikardialen Zellen gerichtet werden, um einen gegebenen Cre-Treiber.
Um die gesamte Epikard unabhängig von Cre Spezifität, eine Reihe von Labors zu beschriften haben Auswuchs cul genutztture Systeme oder ex – vivo – Verfahren der Organkultur zu epikardialen Zellen treu zu isolieren oder zu beschriften , ohne in Abhängigkeit von der Expression eines genetischen Abstammungslinie Marker 26-28. Für die Ex – vivo – Migrationsstudien, sind embryonale Herzen vor dem epikardialen EMT und in Medium mit einem grün fluoreszierenden Protein (GFP) exprimierenden Adenovirus (Ad / GFP) 9,18 ergänzt isoliert. Dieser Ansatz ermöglicht eine effiziente Markierung des gesamten Epikard eher als eine Untergruppe von Zellen, die durch Cre-vermittelte Rekombination. Herz – Kulturen werden anschließend mit bekannten Induktoren von EMT ausgesetzt , um die Mobilisierung von EPDC 28,29 zu stimulieren. Ex – vivo und in – vivo – Analysen werden ergänzt durch in vitro epikardialen Explantation Kulturen, die sind ein besonders nützlicher Ansatz für die Erkundung detaillierten Mechanismen der Fahrt EPDC Migration.
Hier beschreiben wir Verfahren zur Isolierung von primären epikardialen Zellen für in vitro – Studien von epicardial EMT sowie ein Organkultursystem für die ex vivo – Analysen von EPDC Motilität. Wir haben vor kurzem gezeigt , den Nutzen und die Robustheit dieser Methode durch genetisch die myocardin-related transcription factor Modulation (MRTF) / Serum Response Factor (SRF) Signalisierungsachse 9 Aktin-basierte Migration von EPDC zu manipulieren. Während unsere Ergebnisse notwendig für die Regulierung EPDC Migration eines Signalwegs zu markieren, sind diese Verfahren geeignet ist, die Mechanismen zu entwirren, die gemeinsam EPDC Migration und Differenzierung zu orchestrieren. Darüber hinaus könnte das Explantat und ex vivo – Kultursystemen in Funktionsbildschirme implementiert werden , um neue Regulatoren der EPDC Mobilisierung für therapeutische Anwendungen in der Herzregeneration zu identifizieren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier haben wir detaillierte Methoden skizzieren primäre epikardialen Zelle durch Auswuchs zu isolieren und EPDC Migration in ex vivo Herz Kulturen verfolgen. Für Auswuchs Kulturen variiert die geeignete Zeit, um das Epikard abgereicherte Herz zu entfernen leicht zwischen den Experimenten. Eine regelmäßige Überwachung der Explantate nach einer Inkubation über Nacht wird empfohlen, um das Ausmaß der epikardialen Auswuchs zu messen und um das Herz zu extrahieren, bevor Fibroblasten erscheinen. Um sicherzust…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
EMS wurde durch Zuschüsse aus den National Institutes of Health (NIH) [Grant-Nummer R01HL120919] unterstützt; der American Heart Association [Gewährungsnummer 10SDG4350046]; University of Rochester CTSA Auszeichnung von der NIH [Grant-Nummer UL1 TR000042]; und Startup-Mittel aus dem Aab CVRI. MAT wurde zum Teil durch einen Zuschuss an die University of Rochester School of Medicine and Dentistry vom Howard Hughes Medical Institute Med-In-Grad-Initiative unterstützt; und eine institutionelle Ruth L. Kirschstein National Research Service Award von der NIH [Grant-Nummer GM068411].
Materials
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Hyclone | SH3002201 | DMEM |
| Hanks' Balanced Salt Solution | Hyclone | SH3003102 | HBSS |
| Medium 199 | Hyclone | SH3025301 | M199 |
| Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline | Hyclone | SH3002802 | DPBS |
| Fetal Bovine Serum | Gemini | 100-106 | FBS |
| Penicillin/Streptomycin Solution | Hyclone | SV30010 | |
| Corning Biocoat Collagen I, 4-Well Culture Slides | Corning | 354557 | |
| Multiwell 24-well plates | Falcon | 08-772-1 | |
| Dissecting microscope | Leica | M50 | Equipped with Leica KL300 LED might source |
| Confocal miscroscope | Olympus | 1X81 | Equipped with muli-argon laser 405/488/515, FV10-MCPSU laser 405/440/635, 559 laser, and mercury lamp |
| Bioruptor | Diagenode | UCD-200 | |
| Transforming growth factor beta 1 | R&D Systems | 100-B-001 | TGF-β1 |
| Platelet-derived growth factor BB | R&D Systems | 220-BB-010 | PDGF-BB |
| Trizol Reagent | Applied Biosystems | 15596-026 | Caution, hazardous material |
| TURBO DNA-free Kit | Life Technologies | AM1907 | DNaseI |
| iScript cDNA Synthesis Kit | BioRad | 1708891 | |
| UltraPure Glycogen | Life Technologies | 10814-010 | |
| SYBR Green | BioRad | 170-8880 | |
| Protease inhibtor cocktail tablets | Roche | 11836170001 | |
| Alexa Goat-anti-rabbit 488 | Life Technologies | A11008 | Secondary antibody |
| Alexa Goat anti-rabbit 594 | Life Technologies | A-11012 | Secondary antibody |
| Alexa Goat anti-mouse 594 | Life Technologies | A-11005 | Secondary antibody |
| Mouse anti-smooth muscle alpha actin, Cy3-conjugated | Sigma-Aldrich | C6198 | monoclonal antibody, clone 1A4 |
| Mouse anti-Wilms tumor 1 (WT1) | Life Technologies | MA1-46028 | monoclonal antibody, clone 6F-H2 |
| Rabbit anti-ZO1 | Life Technologies | 40-2200 | polyclonal antibody |
| Rabbit anti-Collagen Type 4 | Millipore | AB756P | polyclonal antibody |
| 4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride | Life Technologies | D1306 | DAPI |
| Fluorescent mounting medium | DAKO | S3023 | |
| 16% Paraformaldehyde solution | Electron Microscopy Sciences | 15710 | PFA diluted to 4% in DPBS. Caution, hazardous material |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| Tissue Freezing Medium | Triangle Biomedical Sciences | TFM-B | |
| Pap pen | DAKO | S2002 | |
| Disposable mictrotome blades | Sakura Finetek | 4689 | |
| Microscope slides | Globe Scientific | 1358W | positively charged, 25 x 75 x 1mm |
| Cryostat | Leica | CM1950 | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11295-00 | |
| Surgical Scissors | Fine Science Tools | 91460-11 | |
| Disposable base molds | Fisher Scientific | 22-363-553 | |
| Ketamine | Hospira | NDC 0409-2051-05 | |
| Xylazine | Akorn | NADA 139-236 |
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