抗がん剤の特異性を評価します<em>インビトロ</em

Summary

このプロトコルの目的は、腫瘍および非腫瘍細胞の両方を含む混合培養物を用いてインビトロで抗がん剤の特異性を評価することです。

Abstract

腫瘍および非腫瘍細胞の両方を含む培養物を用いてインビトロで抗がん剤の特異性を評価するための手順が示されています。重要な要素は、デュアルプローブデジタルPCRアッセイおよび腫瘍細胞の割合の後続の計算を使用して、ユニバーサル配列に関連する腫瘍特異的遺伝子変化の定量的な決意です。アッセイは、確立された回線の腫瘍細胞を含む培養で行い、スパイク、非腫瘍細胞れます。混合培養は、様々な濃度の試験薬剤で処理されています。処理の後、DNAを、簡単かつ安価な方法を用いて、96ウェルプレートのウェル中の生存接着細胞から直接調製され、そして腫瘍特異的遺伝子改変および参照ユニバーサル配列を測定するためのデュアルプローブデジタルPCRアッセイに供します。本デモでは、NF1遺伝子のヘテロ接合性欠失は、腫瘍特異的な遺伝子改変として使用され参照遺伝子としてRPP30遺伝子 。比NF1 / RPP30を使用して、腫瘍細胞の割合を算出しました。腫瘍細胞の割合の用量依存的な変化は、薬物の特異性のインビトロでの指標を提供するので、この遺伝的および細胞ベースのインビトロアッセイは、おそらく薬物発見における適用可能性を有することになります。また、パーソナライズされた癌ケアのため、このgenetic-および細胞ベースのツールは、個々の腫瘍の初代培養物を使用して、候補薬物の検査有効性および特異性により、アジュバント化学療法の最適化に寄与することができます。

Introduction

Therapeutic effects of anticancer drugs on tumor cells are associated with various unwished toxic effects on non-tumor cells. Toxic effects are difficult to assess in the laboratory, largely due to the lack of suitable tools¹. Cell cultures containing both tumor and non-tumor cells would provide a potential in vitro resource for assessing specificity or selectivity of a drug which may shed light on clinical toxicity. However, conventional in vitro assays such as proliferation or viability assays measure effect of a drug on total cells, but cannot divide the effect into the part on tumor cells and the part on non-tumor cells. For example, a 50% reduction of total cell number in a culture composed of 50% tumor cells and 50% non-tumor cells can imply death of all tumor cells, death of all non-tumor cells or, more likely, death of parts of both at various ratios.

Also because of this technical problem, primary cultures which contain tumor and non-tumor stromal cells are frequently unsuitable for testing drugs. On the other side, because of this cellular heterogeneity, primary cultures resemble their original tumors far better than clonal cells in established cell lines². More importantly, primary cultures are patient-specific and may enable individualized drug testing^2-4.

An essential issue is therefore the development of a method for determination of the proportion of tumor cells in mixed cultures including primary cultures. Toward this challenge, a genetic solution was conceived which is based on determination of the quantitative ratio of a tumor-specific genetic feature to a universal reference sequence. From this ratio, the proportion of tumor cells in a mixed culture can be calculated.

This study illustrates the procedure of the genetic and cell-based tool for assessing specificity of anticancer drugs including (1) preparing a mixed culture from tumor cells of an established line and non-tumor fibroblasts, (2) treating the mixed culture with a test drug, (3) preparing DNA for digital PCR, (4) determining the ratio of an tumor-specific heterozygous deletion to a reference sequence using a dual-probe droplet digital PCR assay, (5) calculating proportions of tumor cells at each drug concentration and (6) drawing up dose-dependent change of proportion of tumor cells.

Protocol

腫瘍細胞および非腫瘍細胞の両方を含む混合培養の準備1。 MPNST S462 5株化細胞から腫瘍細胞を使用してください。非腫瘍細胞6,7として線維芽細胞を使用してください 10％ウシ胎児血清（BSA）を標準DMEM培地中で培養両方の腫瘍細胞および線維芽細胞、3 mMのグルタミン、0.1mMの2-メルカプトエタノール、500 U / mlペニシリン、37℃で500グラム/ mlのストレプトマイシン及び1mMピルビン酸ナトリウム、5％CO 2 5-7。サブ合流点に、0.05％トリプシンで細胞を採取し、血球計数器を使用してそれらを数えます。 0.2 mlの培地中で96ウェル培養プレートの各ウェル内に共に400腫瘍細胞および1,600の非腫瘍細胞を混合します。 5日間の治療期間にわたって、腫瘍細胞のより速い成長を考慮すると、腫瘍細胞の初期の比率を25％に設定しました。セットアップ4は、各薬物濃度について複製します。 37℃で細胞をインキュベートし、5％CO 2、O ​​/ N。 2. Druのグラムトリートメント試験薬物としてニロチニブを使用してください。 DMSO中の0、2、4、20 mMのニロチニブのストック溶液を準備します。 0、10、20および100μM6.7の2倍濃縮薬剤溶液を得た5mlのDMEM培地で200倍、それらの各々を希釈します。 各ウェルから0.1ミリリットル培地を除去し、薬物を含有する培地の0.1ミリリットルを追加します。最終濃度は0、5、10および50μMです。 5日間薬物を含有する培地中で細胞をインキュベートし続けます。 治療の終了時に、位相差顕微鏡を使用して付着した細胞を検査し、写真を撮ります。離れて培地を吸引除去し、0.2ミリリットルのPBSで一回生き残った接着細胞を洗浄します。 3.デジタルPCRのためのDNAを準備名手8を用いて、細胞を溶解します。 各ウェルに50μlのアルカリ溶解液（25mMのNaOHを、0.2 mMのEDTA）を追加します。ホイルでウェルを密閉します。オーブン中、30分間、加熱板上で95℃でプレートをインキュベートします。 MICRの下でチェックOSCOPEはもはや無傷の細胞をウェルの表面に残っていないことを確認します。ケースでは、細胞は、完全に溶解する加熱時間を増やすか、洗剤を追加しませんでした。 Cも壊す細胞を強化-20℃で一度にそれらをフリーズします。 各ウェルに溶液（40 mMトリスHC、pHは4.0）を中和50μlのを追加します。 10〜30分間、95℃でPCRサイクラーにPCRプレートのU-形ウェルにすべての溶解物を移し、乾燥しました。 20μlの蒸留水で溶解物を再構成します。 ドロップ透析9を使用して脱塩平均孔径0.025ミクロンを有する膜フィルターを使用しています。 12ウェルプレートのウェルで光沢のある面を上にして蒸留水でフィルタをフロート。 5分間フィルターを濡らします。フィルタと水との間に空気の泡を避けるために注意を払います。 ピペット慎重フィルタの4つの領域のそれぞれに上にステップ3.1.4から各サンプルの再構成された溶解物。プレートを覆い、30〜60分間透析。 フィルターを裏返したり滴を乱すことなく、フィルターの下に水を離れて吸います。 新しいPCRプレートのウェルに溶解液滴を転送します。 PCRサイクラーにおいて10〜30分間95℃で加熱することにより、DNA滴を乾燥させます。 10μlの水に溶解物を再構成します。 4.デジタルPCR 、DNAなどの冷凍コンポーネントを解凍バッファリングし、室温でアッセイミックス、（例えば、VWRミニ遠心機）、任意の利用可能な遠心機の最大の力で10秒間スピンダウンした後、氷上で保管してください。 DNA（ 表1）を除くすべての成分を含むマスター混合物を準備します。デッドボリュームを考慮し、必要な量よりも約10％以上のマスター混合物を計算します。 注：市販のキットで使用されるプライマーおよびプローブを使用してください。 渦マスター混合物、任意の利用可能な遠心機（例えば、VWRミニ遠心機）の最大の力で10秒間スピンダウンし、それぞれに15μlずつ分注します96 PCRプレートのウェル。マスター混合物を含むウェルに各サンプルの（DNAを含む）すべての溶解液を追加します。 RTでカートリッジのサンプル側のウェルにそれぞれ20μlの反応混合物を転送します。 カートリッジのオイル側の各ウェルに液滴発生器油の70μLを分注します。ガスケットでカ​​ートリッジを閉じて、液滴発生器に全体の設定を配置します。液滴の生成を開始します。 96ウェルPCRプレートのウェルに移す40μlの滴-ソリューション。ホイルでプレートをシールし、PCRサイクラーにプレートを配置します。 105℃で蓋温度を設定し、2℃/秒でレートをランプアップします。 表2の設定を使用してPCRを行う。PCRは、液滴リーダーにプレートを転送し、読み込みを開始した後。また、最大24時間、4℃でプレートを保存。 前記腫瘍細胞の割合を計算しますデジタルPCRデータをロードし、自動analysを行いますです。 手動で正と負の液滴の1次元および2次元分布を調べることにより、各アッセイの結果を制御し、それらが十分に分離され、閾値ラインは右の位置にあったことを確認してください。結果は、例えば、基準を満たしていない除外、さらなる分析から正および負の液滴の明確な分離、。エクセルシートに結果の比NF1 / RPP30をコピーします 。 2×（1- NF1 / RPP30）：のような腫瘍細胞の割合を計算します。 腫瘍細胞の割合の6用量依存性の変更各薬剤濃度については、4複製からの平均値と標準偏差を計算します。薬物濃度に対する平均と標準偏差をプロットします。

Representative Results

DNAの品質が組み合わされたホットショットを使用して製造/ドロップ透析は満足デジタルPCR（ 図1B）のために十分です。 2000線維芽細胞の場合、約3000±500正滴が予想される4000コピー（1セル内の2つのコピー）の75％に相当する、得られました。本研究では、腫瘍細胞は、NF1遺伝子 5のヘテロ接合欠失を有することが知られている確立された回線MPNST S462からのものでした。この50％の遺伝子量の減少が明らかにデュアルデジタルPCRアッセイ（ 図1B）によって検出しました。対照的に、この遺伝子の2つのコピーは、線維芽細胞で測定しました。腫瘍および非腫瘍細胞との間のこの遺伝的差異は、混合培養物中の腫瘍細胞の割合（ 図2）の計算を可能にします。 RPP30にNF1の相対的な遺伝子量を測定することによって、混合培養中の腫瘍細胞の割合を決定することができます各薬物濃度における（ 図3）。 図1. デジタルPCR。原則の（A）の図。 （B）は、デュアルプローブアッセイは、参照（RPP30）遺伝子に関連した腫瘍細胞MPNST S462における目標（NF1）遺伝子の減少量を明らかにしている。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 図2. 腫瘍細胞の割合を計算した。腫瘍細胞および非腫瘍細胞は、種々の割合で混合し、96プレートの各ウェルに播種しました。添付ファイルO / Nの後、細胞を、ウィットを溶解させました時間名手/ドロップ透析脱塩溶解物をNF1 / RPP30の比を与えたデジタルPCRに供しました。この比の塩基は、各ウェル中の腫瘍細胞の割合を算出しました。平均および4は、それぞれセットアップ割合で複製からの腫瘍細胞の比率の標準偏差を算出しました。腫瘍細胞（Y軸）の計算された割合は、セット・アップ比率（X軸）に対してプロットした。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 腫瘍細胞の割合を 図3 用量依存的変化（A） は、用量依存性の可視生細胞の減少を。 （B）腫瘍細胞の割合（平均および4反復の標準偏差）から計算 NF1の割合： – 10μMRPP30は 、0の範囲で減少しました。最高用量50μMでは、いくつかの重要な細胞が原因で、すべての細胞に毒性効果に、おそらく残っていた。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 非腫瘍細胞とは、腫瘍細胞の 図4 の分離応答 （A）生存率および/ ​​または全細胞の増殖は、従来のアッセイを用いて測定することができます。腫瘍細胞の割合は、本研究で実証手順を用いて決定することができます。 （B）2つのパラメータを使用して、薬物の混合培養中の全細胞の応答は、腫瘍細胞と非腫瘍細胞の応答の応答に分割することができます。.COM /ファイル/ ftp_upload / 53752 / 53752fig4large.jpg "ターゲット=" _空白 ">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 1反応 2×ddPCRスーパーミックス 12 NF1のためのアッセイ混合物 1.2 RPP30のアッセイミックス 1.2 HaeIII 0.6 小計 15 マスター混合物 DNA 9 合計 24 最終PCR混合物 表1は、デュアルddPCR反応を設定します ステップ アクション 温度 時間 サイクル 1 Polymアクティベーションを消去 95°C 10分 1 2 DNAの変性 94°C 30秒 40 3 アニーリング/ exetension 60°C 1分 4 ポリメラーゼの不活性化 98°C 10分 1 5 ホールド（オプション） 4°C 表2 PCRサイクラー設定

Discussion

in vitroでの薬物の特異性を評価するためのこのgenetic-および細胞ベースのツールにおける重要なステップは、一つ以上の腫瘍特異的な遺伝子の機能を用いて腫瘍細胞の割合の決意です。従来の表現型の特徴⁷とは対照的に、遺伝的特徴は、特定の安定および定量化することが容易です。例えば、腫瘍特異的変異またはコピー数の変化は、腫瘍細胞ではなく、非腫瘍細胞に排他的に存在します。そのような遺伝的汚名は、本研究で示されているように、デジタルPCRを使用して、例えば、確実かつ正確に定量することができます。

デジタルPCRは、DNAの高純度は必須ではありません。しかしながら、脱塩および阻害分子を除去するには、適切なフィルタを使用してドロップ透析によって達成することができる必要があります。合わせた溶解およびドロップ透析は、簡単かつ迅速であり、特別な器具を必要とせず、したがって、任意の標準的な実験室で行うことができます。細胞はブレアがない場合よくkは、付加的な治療は、そのような界面活性剤を添加すること及び/又はプロテアーゼを用いて、-20℃で細胞を凍結すると考えることができます。

本研究では、NF1遺伝子のヘテロ接合性欠失は、定量のための腫瘍特異的な特徴として使用しました。同様に、他の遺伝子または遺伝子座の欠失を使用することもできます。さらに、変異は、腫瘍細胞を定量化するために使用することができます。このような場合には、変異体のためのデジタルPCRアッセイおよび正常な対立遺伝子は、広く、それらのそれぞれのためのそれらの特異性を保証するために検証される必要があります。

腫瘍細胞の用量依存性の割合は、薬物特異性または選択のための指標を提供します。さらに、それはまた、薬物（ 図4）の混合培養物の全細胞の応答からの腫瘍細胞の応答を抽出することが可能となります。この抽出戦略の両方の腫瘍を含む（一次培養物を使用して技術的問題に対する解決策を提供しません薬物試験のためのn腫瘍細胞）。

genetic-ため、アプリケーションの可能性を有していてもよい本研究で実証試験管ツールでセルベース（1）それは、in vitroでの薬物特異性または選択性を評価し、ためのプラットフォームを提供し、創薬における（2）パーソナライズされたがん治療中のどこにそれを初代培養で試験薬を可能にし、その結果、補助化学療法⁴に薬剤選択に寄与することができます。特定の遺伝子変化または複数の遺伝的改変は、薬物治療中に追跡することができるので、さらに、薬物の薬理学的メカニズムは、このツールを使用して研究することができます。

個別の初代培養物を使用する際の難しさは、腫瘍細胞の定量のための普遍的な遺伝子機能がないことです。しかし、全ゲノム配列決定における今日の前進で、最も頻繁に変更された遺伝子および領域は、共通の腫瘍のために知られています。例えば、頭頸部のうち腫瘍、71％、23％及び22％がTP53、FAT1およびCDKN2A遺伝子に変異を有し、60％、34％および26％がそれぞれ^{10、CDKN2A、STK11}及びPTENの遺伝子領域に欠失を有します。標的化配列決定および/またはデジタルPCRにより、5〜10このような遺伝子および/または領域をスクリーニングする可能性が高い由来初代培養中の腫瘍細胞の定量化のために使用することができる1つまたは複数の遺伝的変化を同定します。別の制限は、初代培養物を設定するための切除腫瘍のしばしば不十分な量です。

試験管ツールで genetic-とセルベースの有利な特徴と有望な応用の可能性にもかかわらず、その限界は心に留めておくべきであるとそのin vitro性質が強調されるべきです。例えば、腫瘍細胞上の異なる効果、または薬物の細胞毒性ができるむしろによる細胞型（シュワン細胞対線維芽細胞）の差、またはそれらの（異なる個体からの）異なる起源。非腫瘍細胞よりも腫瘍細胞に対する薬物の強い効果はまた、前者が後者よりも速く成長するという事実によって説明することができます。最も重要なことは、 試験管行動中の細胞は人間の体内で細胞よりも異なり、その結果、in vitroでの評価の結果は、多くの場合、実際の臨床状況を反映していないか、部分的にしか行います。そのため、有効性、細胞毒性および培養細胞について得られた薬物の特異性は、むしろバイオマーカーの性質のものであるが、抗生物質の前臨床測定の有効性の信頼性を持っていません。それにもかかわらず、混合培養物および/ ​​または一次培養物に細胞株から移動すると、薬物効果とin vitroでの特異性/選択性を評価する上で一歩前進です。広範な努力で、 インビトロ条件は、少なくともいくつかの薬物のための患者の実際の応答とインビトロのデータの合理的な相関関係を可能に見出すことができます。

Materials

membrane filter of 25 mm diameter	Merk-Millipore	VSWP 02500	for drop-dialysis
ddPCR assay for NF1	BioRad	dHsaCP1000177	FAM-labelled
ddPCR assay for RPP30	BioRad	dHsaCP2500350	HEX-labelled
QX200	BioRad	186-4001	the previous version QX was used in the study, which is not available any more. The replacement is QX200
Droplet oil	BioRad	186-3005
Cartriges	BioRad	186-3004
Gaskets	BioRad	186-3009
Cartrige holder	BioRad	186-3051
pierceble foil	BioRad	181-4040