Målet med denne protokollen er å vurdere spesifisiteten av kreftmedisiner in vitro ved bruk av blandede kulturer som inneholder både tumor og ikke-kreftceller.
En fremgangsmåte for å vurdere spesifisiteten av anticancer legemidler in vitro ved bruk av kulturer inneholdende både tumor- og ikke-tumorceller er demonstrert. Det sentrale element er kvantitativ bestemmelse av en tumor-spesifikk genetisk endring i forhold til en universal-sekvens ved hjelp av en dobbel-sonde digital PCR-analyse, og den etterfølgende beregning av andelen av tumorceller. Analysen blir utført på en kultur inneholdende tumorceller fra en etablert linje og tilsatt-i ikke-tumorceller. Den blandete kultur behandles med et testmedikament i forskjellige konsentrasjoner. Etter behandlingen blir DNA fremstilles direkte fra overlevde klebende celler i brønnene av 96-brønners plater ved hjelp av en enkel og billig metode, og utsatt for en to-sonde digital-PCR-analyse for måling av en tumor-spesifikk genetisk endring, og en referanse universell sekvens . I den foreliggende demonstrasjonen er en heterozygot delesjon av NF1-genet anvendt som tumorspesifikke genetiske endring ogen RPP30 gen som referanse genet. Ved å bruke forholdet NF1 / RPP30, ble andelen av tumorceller beregnet. Siden den doseavhengige endring av andelen av tumorceller gir en in vitro indikasjon for spesifisitet av stoffet, vil denne genetiske og cellebasert in vitro analyse sannsynligvis ha anvendelse potensial i drug discovery. Videre, for personlig kreft-behandling, kan dette genetic- og celle-basert verktøy bidra til å optimalisere adjuvant kjemoterapi ved hjelp av testing effekt og spesifisitet av kandidat narkotika ved hjelp av primærkulturer av enkelte svulster.
Therapeutic effects of anticancer drugs on tumor cells are associated with various unwished toxic effects on non-tumor cells. Toxic effects are difficult to assess in the laboratory, largely due to the lack of suitable tools1. Cell cultures containing both tumor and non-tumor cells would provide a potential in vitro resource for assessing specificity or selectivity of a drug which may shed light on clinical toxicity. However, conventional in vitro assays such as proliferation or viability assays measure effect of a drug on total cells, but cannot divide the effect into the part on tumor cells and the part on non-tumor cells. For example, a 50% reduction of total cell number in a culture composed of 50% tumor cells and 50% non-tumor cells can imply death of all tumor cells, death of all non-tumor cells or, more likely, death of parts of both at various ratios.
Also because of this technical problem, primary cultures which contain tumor and non-tumor stromal cells are frequently unsuitable for testing drugs. On the other side, because of this cellular heterogeneity, primary cultures resemble their original tumors far better than clonal cells in established cell lines2. More importantly, primary cultures are patient-specific and may enable individualized drug testing2-4.
An essential issue is therefore the development of a method for determination of the proportion of tumor cells in mixed cultures including primary cultures. Toward this challenge, a genetic solution was conceived which is based on determination of the quantitative ratio of a tumor-specific genetic feature to a universal reference sequence. From this ratio, the proportion of tumor cells in a mixed culture can be calculated.
This study illustrates the procedure of the genetic and cell-based tool for assessing specificity of anticancer drugs including (1) preparing a mixed culture from tumor cells of an established line and non-tumor fibroblasts, (2) treating the mixed culture with a test drug, (3) preparing DNA for digital PCR, (4) determining the ratio of an tumor-specific heterozygous deletion to a reference sequence using a dual-probe droplet digital PCR assay, (5) calculating proportions of tumor cells at each drug concentration and (6) drawing up dose-dependent change of proportion of tumor cells.
Nøkkeltrinnet i denne genetic- og celle-baserte verktøy for å vurdere medikament spesifisitet in vitro er bestemmelse av andelen av tumorceller ved hjelp av en eller flere av tumor-spesifikke genetiske trekk. I motsetning til konvensjonelle fenotypiske egenskaper 7, genetiske egenskaper er bestemt, stabil og lett å kvantifisere. For eksempel, er en tumor-spesifikk mutasjon eller kopitall variasjon til stede utelukkende i tumorceller, men ikke i ikke-tumorceller. En slik genetisk stigma kan bli pålitelig og nøyaktig kvantifisert, for eksempel ved hjelp av digital PCR som vist i denne studien.
For digital PCR, er høy renhet av DNA ikke avgjørende. Imidlertid avsalting og fjerning av inhiberende molekyler er nødvendig, som kan oppnås ved en rulle dialyse ved bruk av et passende filter. Den kombinerte lysis og drop-dialyse er enkel og rask, krever ingen spesielle instrumenter og kan derfor utføres på en hvilken som helst standard laboratorium. Dersom cellene ikke Break godt, kan ytterligere behandling betraktes som frysing av cellene ved -20 ° C, tilsetning av vaskemiddel og / eller ved hjelp av protease.
I denne studien ble heterozygot sletting av NF1-genet brukes som tumor spesifikk funksjon for kvantifisering. På samme måte kan delesjoner av andre gener eller loci også anvendes. Videre kan mutasjoner også brukes til å kvantifisere tumorceller. I et slikt tilfelle digitale PCR-analyser for mutanten og de normale alleler må være stor utstrekning valideres for å sikre deres spesifisitet for hver av dem.
Doseavhengig andel av tumorceller gir en indikasjon for narkotika-spesifisitet eller selektivitet. I tillegg gjør det også ekstrahere responsen av tumorceller fra responsen av totale celler i en blandet kultur til en medikament (figur 4). Dette utvinning strategien gir en løsning for den tekniske problem i å bruke primærkulturer (som inneholder både svulsten og ingenn-tumor celler) for narkotika-testing.
Den genetic- og cellebasert in vitro verktøy demonstrert i denne studien kan derfor ha anvendelsespotensial (1) i narkotika-funn hvor det gir en plattform for å vurdere stoffet spesifisitet eller selektivitet in vitro og (2) i personlig kreftomsorgen der det muliggjør testing narkotika i primærkulturer og dermed kan bidra til narkotika-utvalget i adjuvant kjemoterapi 4. Videre kan farmakologiske mekanismen av et medikament bli studert ved hjelp av dette verktøyet, siden viss genetisk endring eller flere genetiske forandringer kan følges under legemiddelbehandling.
En vanskelighet i å bruke individuelle primære kulturer er mangelen en universell genetisk funksjon for kvantifisering av tumorcellene. Men med dagens forhånd whole-genomet sekvensering, er de hyppigst forandres gener og regioner er kjent for vanlige tumorer. For eksempel, blant hode og nakketumorer, 71%, 23% og 22% har mutasjoner i TP53, FAT1 og CDKN2A gener, og 60%, 34% og 26% har delesjoner i genet regioner av CDKN2A, STK11 og PTEN, henholdsvis 10. Screening 5 til 10 slike gener eller / og regioner ved hjelp av målrettet-sekvensering og / eller digital PCR vil derfor sannsynligvis identifisere en eller flere genetiske endringer som kan anvendes for kvantifisering av tumorceller i den utledede primærkulturen. En annen begrensning er ofte utilstrekkelig mengde resected svulster for å sette opp primærkulturer.
Til tross for de fordelaktige egenskaper og lovende anvendelsespotensial for den genetic- og cellebasert in vitro verktøy, bør sine begrensninger holdes i bakhodet og dens in vitro natur bør vektlegges. For eksempel, den differensielle effekter eller cytotoksisitet av et medikament for tumorceller kan snarere på grunn av forskjell i celletyper (fibroblaster vs Schwannske celler) eller sinulikt opphav (fra forskjellige individer). Den sterkere effekt av et legemiddel på tumorceller enn på ikke-tumorceller, kan også forklares ved det faktum at de førstnevnte vokser hurtigere enn den sistnevnte. Viktigst, celler in vitro oppførsel avviker enn celler i menneskekroppen og dermed resultater av in vitro-evaluering ofte ikke eller bare delvis gjenspeiler den reelle kliniske situasjon. Derfor, effekt, cytotoksisitet og spesifisitet av medikamenter som oppnås for dyrkede celler er heller fra biomarkør naturen, men har ikke påliteligheten av preklinisk målte effekt av antibiotika. Likevel flytter fra cellelinjer til blandede kulturer og / eller primærkulturer er et skritt fremover i å vurdere legemiddeleffekt og spesifisitet / selektivitet in vitro. Med omfattende innsats, in vitro forhold kan bli funnet som gjør rimelig korrelasjon av in vitro data med ekte reaksjoner fra pasienter, i hvert fall for noen stoffer.
The authors have nothing to disclose.
Mrs. Alster, Mr. Honrath og Dr. Jiang er verdsatt for sine fremragende teknisk assistanse. Også pris er Dr. Volz og forskergruppen av Dr. Dandri for å gi tilgang til sine digitale PCR-enhet.
membrane filter of 25 mm diameter | Merk-Millipore | VSWP 02500 | for drop-dialysis |
ddPCR assay for NF1 | BioRad | dHsaCP1000177 | FAM-labelled |
ddPCR assay for RPP30 | BioRad | dHsaCP2500350 | HEX-labelled |
QX200 | BioRad | 186-4001 | the previous version QX was used in the study, which is not available any more. The replacement is QX200 |
Droplet oil | BioRad | 186-3005 | |
Cartriges | BioRad | 186-3004 | |
Gaskets | BioRad | 186-3009 | |
Cartrige holder | BioRad | 186-3051 | |
pierceble foil | BioRad | 181-4040 |