En forbedret fremgangsmåde til hurtig intubation af trachea i mus

Summary

Denne artikel præsenterer en hurtig og enkel metode til administration af bleomycin direkte i musen luftrøret via intubation. Vigtige fordele ved denne metode er, at det er meget reproducerbar, let at mestre, og kræver ikke specielt udstyr eller langvarige opsving gange.

Abstract

Despite some anatomical and physiological differences, mouse models continue to be an essential tool for studying human lung disease. Bleomycin toxicity is a commonly used model to study both acute lung injury and fibrosis, and multiple methods have been developed for administering bleomycin (and other toxic agents) into the lungs. However, many of these approaches, such as transtracheal instillation, have inherent drawbacks, including the need for strong anesthetics and survival surgery. This paper reports a quick, reproducible method of intratracheal intubation that involves mild inhaled anesthesia, visualization of the trachea, and the use of a surrogate spirometer to confirm exposure. As a proof of concept, 8-12 week old C57BL/6 mice were administered either 2.0 U/kg of bleomycin or an equivalent volume of PBS, and both damage and fibrotic endpoints were measured post-exposure. This procedure allows researchers to treat a large cohort of mice in a relatively short period with little expense and minimal post-procedure care.

Introduction

Til trods for nogle anatomiske og fysiologiske forskelle, ¹ murine modeller fortsat være uvurderlig for modellering human biologi og sygdom patogenese. ^{2 Fra} en dyrehold synspunkt, mus er lette at håndtere, har en lav avl tid, en accelereret levetid, og er relativt billige til hus. Med udviklingen af forskellige genetiske stammer og strategier (f.eks., Betingede knock-outs, reporter mus, slægt-tracing metoder, etc.), samt den brede vifte af tilgængelige reagenser (f.eks., Antistoffer, rekombinante proteiner, inhibitorer, etc.), er mus blevet en afgørende model hvirveldyr organisme at afdække menneskelige homeostase og sygdomsprocesser. ³

Mus har været særligt værdifulde til undersøgelse pulmonale tilstande, herunder akut lungeskade (ALI) og lungefibrose. ⁴ ALI hos mennesker kan være forårsaget af trauma, skade, eller sepsis og er kendetegnet ved epitel- ogendotel lækage (dvs.., ødem), inflammation og spirende fibrose. Hos mange patienter ALI udvikler sig til dens alvorlige form, akut lungesvigt (ARDS), hvilket ofte resulterer i fibrose og død på grund af respiratorisk svigt. ^5,6 Pulmonal fibrose er en progressiv, dødelig patologi karakteriseret ved overskydende aflejring af ekstracellulær matrix , især kollagen type l, hvilket fører til nedsat lungefunktion. ^7,8 Administration af bleomycin (BLM) er den mest udbredte og bedst karakteriserede model til induktion ALI og fibrose hos forsøgsdyr. ^{9 Selv} BLM-induceret lungefibrose hos gnavere gør ikke rekapitulere fuldt humane fibrotiske fænotyper, har ¹⁰ musestudier med denne model førte til opdagelsen af mange vigtige faktorer, der påvirker debut og progression af sygdommen. ¹¹

Mens den nøjagtige mekanisme (r) bag BLM-induceret fibrogenese er ukendte, den initierende skademenes at stamme fra kontakt-afhængige DNA strengbrud i epitelceller, der beklæder ledende luftveje og alveoler og navnlig, type 1 pneumocytter. ^12. Behovet for direkte kontakt mellem BLM og pulmonal epitel understreger betydningen af en solid levering rute , og disse bekymringer er også relevant for en bred vifte af behandlinger målrettet til de distale luftveje, herunder rekombinante proteiner, antistoffer, siRNA, virus, bakterier, partikler og mere. Oropharyngeal aspiration (OPA) har været meget anvendt til dette formål ^13, men en større en mangel ved OPA er, at en vis del af den leverede middel kan sluges i mavetarmkanalen, hvilket fører til unøjagtighed i den administrerede dosis. En anden almindeligt anvendt fremgangsmåde er transtracheal instillation, som involverer trakeostomi under stærk bedøvelse for at eksponere luftrøret og inddrypning af et middel direkte ind i luftvejene. ¹⁴ imidlertid ikke alene kan disseen procedure være uønsket på grund af sin invasivitet, men det er også tidskrævende, kræver en retfærdig bit af uddannelse, og forårsager en potent skade luftvejene er blevet udviklet. ^15,16 Flere protokoller, der involverer den direkte administration af midler til trachea uden behov for kirurgisk intervention, ^{16,17,18,19,20} men disse fremgangsmåder involverer forlænget genstartstider forårsaget af kraftige anæstetika, brug af dyrt udstyr (dvs.., otoskop / laryngoskop, kommercielt tilgængelige procedure boards, fiberoptisk ledninger, etc.), et overskud af manipulation i mundhulen, og usikkerhed med hensyn til dosering.

Dette papir beskriver en forholdsvis let metode til indgivelse via intubation, der tillader en forsker for hurtigt, billigt og pålideligt bibringe et reagens i den murine lunge med begrænset risiko for resterende skader på det omgivende væv.

Protocol

Institutional Animal Care og Brug udvalg (IACUC) ved University of Washington og Cedars-Sinai Medical Center har godkendt dyret arbejde er nødvendigt for disse undersøgelser. 1. Fremstilling Sterilisere både de stumpe ende pincet og den depressor via autoklaven. Ved hjælp af en biologisk sikkerhedsskab, forberede en arbejdsgruppe bestand af BLM i PBS fra det frysetørrede pulver. Sonikeres opløsningen i 10 minutter ved 35 kHz for at sikre ensartet blanding. Bemærk: et samlet vol…

Representative Results

Intuberet mus blev overvåget dagligt for vægttab og nød, og ofret 4, 10 eller 17 dage senere via intraperitoneal injektion af 2,5% 2,2,2 tribromethanol. Bronkoalveolær lavage (BAL) blev indsamlet i tre vaske PBS som beskrevet andetsteds 21 og højre lunge blev fikseret i 10% formalin, paraffin indlejret og farvet med Massons Trichrome af University of Washington Histologi og Imaging Core 22. <p class="jove_content" fo:keep-together.within-p…

Discussion

I tilfælde, hvor aerosolisering er upraktisk på grund af begrænset reagens tilgængelighed, sikkerhed eller pris, direkte tracheal administration er en overlegen metode til afgivelse af eksogene midler ind i lungerne ¹⁶ transtracheal instillation har været meget anvendt til at opnå dette.; Men som med alle kirurgiske indgreb, det indebærer også en risiko for komplikationer som følge af selve proceduren, og ikke nødvendigvis det middel, der indpodet. ¹³ Af disse grunde er…

Materials

Bleomycin For Injection, 30 units/vial	APP Pharmaceuticals, LLC	103720	For best results, BLM should be suspended in PBS, aliquoted, and stored as single use lyophilzed aliquots
Blunt End Forceps	N/A	N/A
Tongue Depressor (i.e. bent Valleylab Blade Electrode, 2.4")	Covidien	E1551G	Before use, create a 45 degree bend 1.5 cm  from the blade tip. A suitable depressor can also be created from any metal implement of similar dimensions.
Exel Safelet Catheter 22G X 1"	Exel International	26746
1 mL Slip-tip Disposable Tuberculin Syringe (200/sp, 1600/ca)	BD	309659
0.2ml Pipettor and Filter Tips	N/A	N/A
Fiber-Lite Illuminator. Model 181-1: Model 180 mated with Standard Dual Gooseneck illuminator	Dolan Jenner Industries, Inc.	181-1	Lower output LED illuminators are not recommended as they fail to suficiently illuminate the trachea.
Intubation Board	N/A	N/A	See Diagram 1.
Colored Label Tape: 0.5 in. Wide	Fisherbrand	15-901-15A
Oxygen	N/A	N/A
Phosphate-Buffered Saline, 1X	Corning	21-040-CV	Product should be sterile
Non-Sterile Silk Black Braided Suture Spool, 91.4 m, Size 4-0	Harvard Apparatus	517698
Table Top Anesthesia Machine Isoflurane	Highland Medical Equipment	N/A	http://www.highlandmedical.net/
Slide Top Induction Mouse Isoflurane Chamber	MIP / Anesthesia Technologies	AS-01-0530-SM
FORANE (isoflurane, USP) Liquid For Inhalation 100 mL	Baxter	1001936040
Nanozoomer Digital Pathology system	Hamamatsu
IgM ELISA Quantification Kit	Bethyl Laboratories	E90-101