En förbättrad metod för Rapid Intubation av luftstrupen hos möss
Summary
I denna artikel presenteras en snabb och enkel metod för att administrera bleomycin direkt i musen luftstrupen via intubation. Viktigaste fördelarna med denna metod är att det är mycket reproducerbar, lätt att bemästra, och inte kräver specialutrustning eller långa återhämtningstider.
Abstract
Despite some anatomical and physiological differences, mouse models continue to be an essential tool for studying human lung disease. Bleomycin toxicity is a commonly used model to study both acute lung injury and fibrosis, and multiple methods have been developed for administering bleomycin (and other toxic agents) into the lungs. However, many of these approaches, such as transtracheal instillation, have inherent drawbacks, including the need for strong anesthetics and survival surgery. This paper reports a quick, reproducible method of intratracheal intubation that involves mild inhaled anesthesia, visualization of the trachea, and the use of a surrogate spirometer to confirm exposure. As a proof of concept, 8-12 week old C57BL/6 mice were administered either 2.0 U/kg of bleomycin or an equivalent volume of PBS, and both damage and fibrotic endpoints were measured post-exposure. This procedure allows researchers to treat a large cohort of mice in a relatively short period with little expense and minimal post-procedure care.
Introduction
Trots vissa anatomiska och fysiologiska skillnader, 1 musmodeller fortsätter att vara ovärderlig för modellering humanbiologi och sjukdomar patogenes. 2 Ur djurhållning synpunkt möss är lätta att hantera, har en låg avel tid, en accelererad livslängd och är relativt billiga till huset. Med utvecklingen av olika genetiska stammar och strategier (t.ex.., Villkor knock-outs, reporter möss, härstamning-spårning metoder, etc.), samt det breda utbudet av tillgängliga reagens (eg., Antikroppar, rekombinanta proteiner, hämmare, etc.), har möss blivit en viktig modell ryggradsdjur organism att avslöja humana homeostas och sjukdomsprocesser. 3
Möss har varit särskilt värdefullt för att studera lungsjukdomar, inklusive akut lungskada (ALI) och lungfibros. 4 ALI hos människor kan orsakas av trauma, skada, eller sepsis och kännetecknas av epitelial ochendotel läcka (dvs., ödem), inflammation, och begynnande fibros. Hos många patienter fortskrider ALI till sin allvarligaste formen, akut andnödssyndrom (ARDS), vilket ofta resulterar i fibros och dödsfall till följd av andningssvikt. 5,6 Lungfibros är en progressiv, dödlig patologi kännetecknas av överskott avsättning av extracellulär matris , framför allt typ i-kollagen, vilket leder till försämrad lungfunktion. 7,8 Administration av bleomycin (BLM) är den mest använda och bäst karakteriserade modell för att inducera ALI och fibros hos försöksdjur. 9 Även BLM-inducerad lungfibros hos gnagare gör inte sammanfatta helt mänskliga fibrotiska fenotyper har 10 mus studier med denna modell har lett till upptäckten av många viktiga faktorer som påverkar uppkomsten och utvecklingen av sjukdomen. 11
Även om den exakta mekanismen (s) bakom BLM-inducerad fibrogenes är okända, det inledande skadatros härröra från kontakt beroende DNA-strängbrott i epitelceller som bekläder luftvägarna och alveoler och i synnerhet typ 1 pneumocyter. 12 Behovet av direktkontakt mellan BLM och lung epitel understryker vikten av en stabil leveransrutt , och dessa problem är också relevant för ett brett utbud av behandlingar riktade mot de distala luftvägarna, inklusive rekombinanta proteiner, antikroppar, siRNA, virus, bakterier, partiklar, och mycket mer. Orofaryngeal aspiration (OPA) har använts i stor utsträckning för detta ändamål 13, men en stor en brist i OPA är att någon del av den levererade medlet kan sväljas i mag-tarmkanalen, vilket därigenom leder till inexakthet i den administrerade dosen. En annan vanligt förekommande metod är transtrakeal instillation, vilket innebär trakeostomi under stark anestesi för att exponera luftstrupen och instillation av en agent direkt ner i luftvägarna. 14 Men inte bara kan en sådanett förfarande vara önskvärt på grund av dess invasivity, men det är också tidskrävande, kräver en hel del träning, och orsakar en potent skada luftvägarna. 15,16 Flera protokoll har utvecklats som involverar direkt tillförsel av medel till trakea utan behov av kirurgiskt ingrepp, 16,17,18,19,20 men dessa metoder innefattar förlängda återhämtningstider som orsakas av kraftiga anestetika, användning av dyr utrustning (dvs., otoskop / laryngoscopen, kommersiellt tillgängliga Förfarande brädor, fiberoptiska ledningar, etc.), ett överskott av manipulation i munhålan, och osäkerhet om doseringen.
Detta dokument beskriver en relativt enkel metod för administration via intubation som tillåter en forskare att snabbt, billigt och tillförlitligt ingjuta ett reagens i den murina lungan med begränsad risk för kvarvarande skador på omgivande vävnader.
Protocol
Representative Results
Discussion
I fall där aerosolbildning är opraktisk på grund av begränsad reagens tillgänglighet, säkerhet, eller kostnad, är direkt trakeal administration en överlägsen metod för leverans av exogena medel i lungorna 16 transtrakeal instillation har använts i stor utsträckning för att åstadkomma detta. Men som med alla kirurgiska ingrepp, bär den också med sig risken för komplikationer orsakade av själva förfarandet, och inte nödvändigtvis det medel som ingjutit. 13 Av d…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna tackar Brian Johnson i histologi och Imaging Core vid University of Washington för att få hjälp med trikromfläckning och analys. Detta arbete stöddes av NIH bidrag HL098067 och HL089455.
Materials
| Bleomycin For Injection, 30 units/vial | APP Pharmaceuticals, LLC | 103720 | For best results, BLM should be suspended in PBS, aliquoted, and stored as single use lyophilzed aliquots |
| Blunt End Forceps | N/A | N/A | |
| Tongue Depressor (i.e. bent Valleylab Blade Electrode, 2.4") | Covidien | E1551G | Before use, create a 45 degree bend 1.5 cm from the blade tip. A suitable depressor can also be created from any metal implement of similar dimensions. |
| Exel Safelet Catheter 22G X 1" | Exel International | 26746 | |
| 1 mL Slip-tip Disposable Tuberculin Syringe (200/sp, 1600/ca) | BD | 309659 | |
| 0.2ml Pipettor and Filter Tips | N/A | N/A | |
| Fiber-Lite Illuminator. Model 181-1: Model 180 mated with Standard Dual Gooseneck illuminator | Dolan Jenner Industries, Inc. | 181-1 | Lower output LED illuminators are not recommended as they fail to suficiently illuminate the trachea. |
| Intubation Board | N/A | N/A | See Diagram 1. |
| Colored Label Tape: 0.5 in. Wide | Fisherbrand | 15-901-15A | |
| Oxygen | N/A | N/A | |
| Phosphate-Buffered Saline, 1X | Corning | 21-040-CV | Product should be sterile |
| Non-Sterile Silk Black Braided Suture Spool, 91.4 m, Size 4-0 | Harvard Apparatus | 517698 | |
| Table Top Anesthesia Machine Isoflurane | Highland Medical Equipment | N/A | http://www.highlandmedical.net/ |
| Slide Top Induction Mouse Isoflurane Chamber | MIP / Anesthesia Technologies | AS-01-0530-SM | |
| FORANE (isoflurane, USP) Liquid For Inhalation 100 mL | Baxter | 1001936040 | |
| Nanozoomer Digital Pathology system | Hamamatsu | ||
| IgM ELISA Quantification Kit | Bethyl Laboratories | E90-101 |
References
- Hyde, D. M., Hamid, Q., Irvin, C. G. Anatomy, pathology, and physiology of the tracheobronchial tree: emphasis on the distal airways. J Allergy Clin Immunol. 124, S72-S77 (2009).
- Rosenthal, N., Brown, S. The mouse ascending: perspectives for human-disease models. Nat Cell Biol. 9, 993-999 (2007).
- Peters, L. L., et al. The mouse as a model for human biology: a resource guide for complex trait analysis. Nat Rev Genet. 8, 58-69 (2007).
- Baron, R. M., Choi, A. J., Owen, C. A., Choi, A. M. Genetically manipulated mouse models of lung disease: potential and pitfalls. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 302, 485-497 (2012).
- Sharma, S. Acute respiratory distress syndrome. BMJ Clin Evid. 2010, (2010).
- Saguil, A., Fargo, M. Acute respiratory distress syndrome: diagnosis and management. Am Fam Physician. 85, 352-358 (2012).
- Wilson, M. S., Wynn, T. A. Pulmonary fibrosis: pathogenesis, etiology and regulation. Mucosal Immunol. 2, 103-121 (2009).
- Wuyts, W. A., et al. The pathogenesis of pulmonary fibrosis: a moving target. Eur Respir J. 41, 1207-1218 (2013).
- Mouratis, M. A., Aidinis, V. Modeling pulmonary fibrosis with bleomycin. Curr Opin Pulm Med. 17, 355-361 (2011).
- Moeller, A., Ask, K., Warburton, D., Gauldie, J., Kolb, M. The bleomycin animal model: a useful tool to investigate treatment options for idiopathic pulmonary fibrosis?. Int J Biochem Cell Biol. 40, 362-382 (2008).
- Myllärniemi, M., Kaarteenaho, R. Pharmacological treatment of idiopathic pulmonary fibrosis – preclinical and clinical studies of pirfenidone, nintedanib, and N-acetylcysteine. European Clinical Respiratory Journal. 2, (2015).
- Reinert, T., Baldotto, C. S. d. R., Nunes, F. A. P., Scheliga, A. A. d. S. Bleomycin-Induced Lung Injury. Journal of Cancer Research. 2013, 1-9 (2013).
- Lakatos, H. F., et al. Oropharyngeal aspiration of a silica suspension produces a superior model of silicosis in the mouse when compared to intratracheal instillation. Exp Lung Res. 32, 181-199 (2006).
- Helms, M. N., Torres-Gonzalez, E., Goodson, P., Rojas, M. Direct tracheal instillation of solutes into mouse lung. J Vis Exp. , (2010).
- Osier, M., Oberdorster, G. Intratracheal inhalation vs intratracheal instillation: differences in particle effects. Fundam Appl Toxicol. 40, 220-227 (1997).
- Driscoll, K. E., et al. Intratracheal instillation as an exposure technique for the evaluation of respiratory tract toxicity: Uses and Limitations. Toxicol Sci. 55, 24-35 (2000).
- MacDonald, K. D., Chang, H. Y., Mitzner, W. An improved simple method of mouse lung intubation. J Appl Physiol (1985). 106, 984-987 (1985).
- Spoelstra, E. N., et al. A novel and simple method for endotracheal intubation of mice. Lab Anim. 41, 128-135 (2007).
- Cai, Y., Kimura, S. Noninvasive intratracheal intubation to study the pathology and physiology of mouse lung. J Vis Exp. , e50601 (2013).
- Starcher, B., WIlliams, I. A method for intratracheal instillation of endotoxin into the lungs of mice. Lab Anim. 23, 234-240 (1989).
- Daubeuf, F., Frossard, N. Performing bronchoalveolar lavage in the mouse. Curr Protoc Mouse Biol. 2, 167-175 (2012).
- Li, Y., et al. Severe lung fibrosis requires an invasive fibroblast phenotype regulated by hyaluronan and CD44. J Exp Med. 208, 1459-1471 (2011).
- Grazioli, S., et al. CYR61 (CCN1) overexpression induces lung injury in mice. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 308, L759-L765 (2015).
- Redente, E. F., et al. Tumor necrosis factor-alpha accelerates the resolution of established pulmonary fibrosis in mice by targeting profibrotic lung macrophages. Am J Respir Cell Mol Biol. 50, 825-837 (2014).
- Lawrenz, M. B., Fodah, R. A., Gutierrez, M. G., Warawa, J. Intubation-mediated intratracheal (IMIT) instillation: a noninvasive, lung-specific delivery system. J Vis Exp. , e52261 (2014).
