Summary
Uma metodologia para a obtenção de informação sobre a estrutura de raiz visual e quantitativa a partir de dados de raios-X de tomografia computadorizada adquiridos em solo é apresentada.
Abstract
As raízes das plantas desempenham um papel fundamental nas interações planta-solo-micróbio que ocorrem na rizosfera, bem como processos com implicações importantes para as alterações climáticas e manejo da cultura. informações de tamanho quantitativo em raízes em seu ambiente nativo é inestimável para estudar o crescimento das raízes e processos ambientais que envolvem plantas. De raios-X de tomografia computadorizada (XCT) foi demonstrado ser uma ferramenta eficaz para a verificação da raiz in situ e análise. Nosso objetivo foi desenvolver uma ferramenta sem custos e eficiente que se aproxima da superfície eo volume da raiz, independentemente da sua forma a partir de dados tridimensional tomografia (3D). A estrutura de raiz de um dropseed Prairie (heterolepis Sporobolus) espécime foi fotografada usando XCT. A raiz foi reconstruído, e a estrutura de raiz primária foi extraído a partir dos dados usando uma combinação de software licenciado e de código aberto. Uma malha poligonal isosurface foi então criado para facilitar a análise. Nós desenvolvemos tele autônomo aplicativo imeshJ, gerada em MATLAB 1, para calcular o volume de raiz e área de superfície da malha. As saídas de imeshJ são a área da superfície (em mm 2) e o volume (em mm 3). O processo, que utiliza uma combinação única de ferramentas de imagem para análise quantitativa da raiz, está descrito. Uma combinação de XCT e software de código aberto provou ser uma combinação poderosa de forma não invasiva amostras de raízes de plantas imagem, dados de raiz segmento, e extrair informação quantitativa a partir dos dados 3D. Esta metodologia de processamento de dados 3D devem ser aplicáveis a outros sistemas de material / amostra onde há conectividade entre os componentes de atenuação de raios-X semelhantes e dificuldades surgem com a segmentação.
Introduction
Roots, como parte da rizosfera 2-5, representam uma parte "invisível" da biologia da planta, desde o solo torna difícil para as raízes de imagem não-invasiva 6, 7. No entanto, estudar o crescimento das raízes e interação dentro do ambiente do solo é fundamental para a compreensão o crescimento das raízes / planta e ciclagem de nutrientes, o que por sua vez afetam arborização, segurança alimentar e climática. Raios-X a tomografia computadorizada (XCT) provou ser uma ferramenta valiosa para a imagiologia não invasivo de amostras de raízes de plantas em seus ambientes locais 8. A fim de medir o desenvolvimento de raiz e alterações dimensionais sob diferentes condições, e ser capaz de comparar dados de diferentes conjuntos de dados / espécimes, é preciso extrair informação quantitativa a partir dos dados de tomografia. A segmentação dos dados de raiz a partir do que o solo circundante, isto é, o isolamento da imagem de raiz de todo o resto em torno dele (incluindo, por exemplo, uma planta vizinha) é um passo crítico antes Accuanálise de tamanho de taxa pode ser feito. No entanto, uma abordagem limite simples é muitas vezes inviável para os dados de raiz. Os desafios associados com as raízes das plantas de imagem no solo incluem variações nas propriedades de atenuação de raios-X do material de raiz, ea sobreposição de valores de atenuação entre raízes e do solo causada pela água e matéria orgânica. Estas questões foram soberbamente abordada recentemente pelo Mairhofer et al. em seu visual ferramenta de acompanhamento RooTrak 7, 9. O próximo passo após uma segmentação de sucesso é a determinação precisa do volume de raiz e área de superfície. O volume pode ser estimado pela contagem do número de voxeis e multiplicando por tamanho em cubos dos voxels como mostrado anteriormente 7. Para uma determinação mais precisa da área de superfície da raiz e do volume, a iso-superficie do sistema radicular segmentado pode ser representado por uma malha de triângulos, usando um algoritmo conhecido como marcha cubos 10. O open-source ImageJ 11 pode ser empregado para aproximar thvolume de raiz e com base no algoritmo Marching Cubes. Para o melhor de nosso conhecimento, apenas um número limitado de software de código aberto dedicado a calcular os dados de volume / superfície à base de tomografia para espécimes de raiz no intervalo centímetro e acima está disponível 12. Um software de fonte aberta que olhou para 13 centra-se no crescimento radicular e destina-se a características celulares que permitem a análise do volume quantitativo em resolução de uma única célula. Alguns softwares de código aberto dedicado a sistemas de raiz toda a 14 é excelente para sistemas radiculares tubular de pequeno diâmetro com base na aproximação que a sua forma é realmente tubular. No entanto, alguns trabalhos com imagens em 2D e são incapazes de lidar com 3D pilhas 14. Além disso, a forma aproximação tubular pode não ser válida quando os sistemas radiculares com superfícies ásperas e formas não uniformes, tais como os de árvores, são estudadas. Outra abordagem 15 usa duas dimensões (2D) sequências de imagens de rotação inovadora contornando the precisa de um scanner CT caro. Ele mede, registros e exibe raiz comprimentos sistema. O software testámos daqueles só está disponível comercialmente 16-18; um não parece ser capaz de lidar com imagem 3D pilhas 16, o segundo é uma ferramenta de área foliar e medição do comprimento radicular 17, enquanto o terceiro é baseado na análise de cor 18. Com base nesse levantamento, sugerimos que uma opção sem custo que se aproxima da superfície eo volume da raiz, independentemente da sua forma a partir de dados de tomografia 3D é desejável.
Com base na RooTrak livremente disponível e ImageJ, temos desenvolvido um programa, chamado imeshJ (ver arquivo de código Suplementar), que processa uma malha isosurface (arquivo de estereolitografia superfície) gerado a partir de dados de raiz segmentados, e calcula a área de volume e superfície da raiz, fazendo cálculos geométricos simples sobre os dados de malha de índice triângulo. Aqui nós relatamos um método que combina o uso de imagens XCT,reconstrução dos dados e visualização (software CT Pro 3D e VG Studio), a segmentação da raiz da amostra do solo nos dados 3D (ImageJ software open-source e RooTrak), e extração das informações de superfície e volume a partir de uma malha triangular (ImageJ eo imeshJ código de computador).
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Protocol
Atenção: O funcionamento de um scanner de tomografia de raios-X requer tanto a formação de radiação em geral, e treinamento de segurança de radiação específica do instrumento. Todos os procedimentos correspondentes relevantes para o laboratório do experimentador deve ser seguido.
Imagem 1. Raiz
Nota: Esta etapa descreve a imagem de um espécime grama mantidos no seu solo original em um vaso de plástico tubular (um tubo de plástico com um diâmetro de 40 mm, uma altura de 210 mm e espessura de parede de cerca de 2 mm).
- Coloque plantas envasadas no manipulador de amostra do instrumento a uma distância desejada para ampliação alvo. Para obter uma planta de um suporte de um diâmetro de 2 polegadas, a amostra a distância fonte deve ser de cerca de 3 polegadas (7 cm).
- Ajuste as configurações de digitalização de raios-X para atingir a cor ideal (nível de cinza) o contraste da imagem detector in. Nota: Estas definições estão disponíveis no software de controle de instrumento utilizado.
- configurações de energia de raios-X Set; 85 kV e 190 uA foram utilizados neste exameple.
- Definir tempo de exposição. Aqui, utilizou-se um tempo de exposição relativamente longo de 1 seg para uma melhor relação sinal-ruído.
- Defina o número de projeções e quadros por projeção; 4 quadros por projecção para um total de 3.142 projeções é sugerido para boas estatísticas de dados.
- Executar uma correção de sombreamento usando as condições de medição indicados acima, selecionando a guia "correção Shading", e clicar em "Criar".
Nota: A correcção de sombreado compensa a variação na resposta dos pixels do dispositivo de imagem quando iluminado com um conjunto de fluxo constante de raios-X. O processo leva imagens em branco (com a amostra removida do caminho do feixe) com o feixe de raios-X é ligado e com o feixe de desligado. Esta correção é aplicada a todas as imagens recolhidas. - Selecione a opção "Minimizar artefactos anel" (também chamado "modo de vaivém"); a amostra será rodado em passos angulares, enquanto as imagens de projeção são adquiridos. Isto leva a DATa aquisição a uma taxa mais lenta, mas ajuda a eliminar artefactos anel.
- Inicie a digitalização, clicando no botão "Acquire" sob a guia Acquisition (com as configurações descritas acima, coleção de imagens levará cerca de 4 horas).
Reconstrução 2. Dados
Nota: Esta seção descreve a reconstrução de dados de volume 3D a partir de imagens RAW (radiografias da tomografia computadorizada).
- Carregar os dados em bruto para o programa.
- Compare primeira e última imagem (que deve ser quase idêntico ao da última imagem é tomada depois de uma rotação da amostra 360 o) para garantir que o espécime não se mexeu ou as configurações de digitalização não se alterou durante a aquisição de dados.
- Calcular o centro de rotação (COR), selecionando a guia "centro de rotação", e clicar em "Iniciar"; opções de uso "Automatic" COR encontrar com "alta qualidade" precisão, e "Dual" (superior e inferior) slice seleição para o cálculo COR.
- Selecione o volume da amostra a ser reconstruída: selecione a guia "Volume", e editar as janelas de seleção de volume usando as miniaturas.
- Execute reconstrução para criar o arquivo de volume contendo dados 3D, clicando em "Iniciar".
3. Data Processing / Segmentação
Nota: Esta seção descreve as medidas a serem tomadas para preparar os dados reconstruídos para processamento adicional na RooTrak programa para rastrear raízes como eles se ramificam através do solo, e isolar as raízes de qualquer material circundante para produzir uma pilha de imagens binárias de apenas o própria raiz.
- Processamento de dados de volume em ImageJ para preparar um RooTrak pilha de processável:
- Carregar o arquivo de volume em ImageJ.
- Otimizar o contraste de imagem entre raiz e solo, ajustando as configurações de brilho e contraste (Clique na imagem / Ajustar / Brilho / Contraste). Quando a região de interesse dentro da imagem é visível e Claramente distinguíveis, as configurações são consideradas otimizado.
- Salvar como uma pilha de imagens em JPEG, BMP ou PNG.
- Processamento na RooTrak para o segmento de raiz:
- Carregar a pilha de em RooTrak (vá em "Ferramentas", e pressione "Tracker").
- Definir pontos de semente dentro de root: clique vários pontos dentro de cada uma das secções de raiz pertinentes visíveis na vista superior fatia dos dados de volume.
- Defina os parâmetros Tracker "Suavidade" e "similaridade" para 0,3 e 0,8, respectivamente.
- Executar a função de rastreamento. Esta seguirá a raiz da fatia de imagem superior todo o caminho até a fatia inferior.
- Depois de ver os dados de volume, selecionar o número de fatias de acordo com o volume de dados utilizável; Neste caso, o acompanhamento foi parado em fatias 200, equivalente a uma profundidade de 6,2 mm, em que as fronteiras de raiz adoeceu-definido (a imagem da raiz rastreados começaram a misturar-se que do solo).
Note opilha de imagens produzidas serão salvos automaticamente para onde quer que o diretório de saída foi criado.
4. Volume e Análise de Superfície
Nota: Esta etapa descreve a geração de malha isosurface da pilha imagem criada por RooTrak.
- Converter pilha de imagens de RooTrak em um formato de imagem binária em ImageJ. Selecione "Processo", então "Binário", depois "Make Binary".
- Use o plugin ImageJ open-source, BoneJ, para criar a malha triangular; em ImageJ selecione "Plugins", então "BoneJ", então "isosuperfície".
- Defina "Resampling" e "Threshold" a 6 e 120, respectivamente (as configurações padrão). Marque a opção "Mostrar superfície", e pressione o botão "OK".
- Sobre o "visualizador 3D", clique na guia Arquivo, em seguida, em "superfícies de Exportação", em seguida, salvar como "STL (binary)".
- Abrir imeshJ, selecione o arquivo STL e digite o tamanho voxel em microns. Clique em "CÁrea de Superfície alculate "para adquirir área de superfície total de raízes amostra em mm 2. Da mesma forma, clique em" Calcular Volume "para obter volume total raiz amostra em mm3.
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Representative Results
A amostra que consiste em duas hastes de relva nativa Prairie dropseed (Sporobolus heterolepis) e o solo original em torno dele foi feita a partir de uma área residencial e colocado num pequeno suporte em forma de tubo visto na Figura 1. O tamanho reconstruída do voxel de dados foi de aproximadamente 31 um x 31 um x 31 um. O arquivo de volume reconstruído foi usada para criar uma pilha de imagens a partir de uma orientação selecionada (vista superior) utilizando o programa de processamento de imagem open-source ImageJ 1.6 11. Os dados de volume também foi iluminada neste programa para aumentar o contraste entre os valores de raiz e solo. A partir dos dados reconstruídos, ficou claro que a raiz e alguns componentes do solo, matéria orgânica mais provável, tem factores de atenuação de raios X muito semelhantes, resultando em pouca ou nenhuma contraste na escala de cinzentos das imagens (Figura 2).
RooTrak, o programa usado para a segmentação, é um programa de código aberto desenvolvido no Centro de Biologia Integrativa da planta na Universidade de Nottingham 7. Ele é projetado especificamente para rastrear raízes como eles se ramificam através do solo, e isolar as raízes do material circundante para produzir uma pilha de imagens binárias. RooTrak foi mostrado para produzir segmentações melhores do que simples de limiar para os dados de raiz 7, 9. Um ponto de semente foi seleccionada dentro de cada uma das secções da raiz pertinentes visíveis na parte superior da fatia dos dados de volume (Figura 3), em seguida, a função de seguimento do software foi executado. Os parâmetros RooTrak "Suavidade" e "similaridade" foram ajustados para 0,3 e 0,8 respectivamente. Esta gama constantemente proporciona boa separação valor de cinza e isola a região de interesse também. RooTrak segmentado com sucesso os selecionados 200 fatias de dados de volume (Figura 4), o que foi equivalente a uma profundidade de 6,2 mm. veja SEGME ntation da raiz no arquivo de animação (Rootvideo.mov).
ImageJ foi utilizado para gerar uma malha triangular, isosuperfície, do volume 3D (aproximar da superfície da raiz isolado) a partir dos dados produzidos pelo RooTrak (Figura 5). As configurações padrão empregadas para "Resampling" e "Threshold" no ImageJ plug-in BoneJ (ver 4.3 na Protocol) foram selecionados porque eles produzem um isosurface detalhada de uma forma relativamente rápida. Ajustar o nível de reamostragem afetará a quantidade de tempo que leva para processar o isosurface. A malha foi salvo no formato STL, e imeshJ foi usado para calcular a área de superfície e volume de malha. Para o volume reconstruído no presente estudo, a área superficial calculada foi de 351,87 milímetros 2, e o volume de 47,27 milímetros 3 (ver Figura 6).
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Figura 1. Os espécimes vivos utilizados no estudo. A amostra grama foi fotografada na terra natal em um 7 "de altura, 1,5" pote de plástico de diâmetro. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. A segmentação Problema esquerda:. Vista de cima de uma fatia horizontal da amostra mostrando matéria orgânica componentes (OM) de nível de cinza semelhante ao da raiz Direita:. Renderização em 3D dos dados mostra todos os componentes que são de cinza semelhante nível para a raiz. por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
. Figura 3. Ponto de partida em RooTrak Superior esquerdo: Opinião superior de fatia de dados de volume, onde a semeadura é iniciado; Top direita: vista aumentada da fatia são marcados por um quadrado vermelho na figura à esquerda, pontos sementes são selecionadas dentro da raiz pertinente . seção transversal; inferior: a raiz saturado na cor vermelha é selecionado para segmentação por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4. Comparação de fatias de RooTrak. Três pares representativos de vista superior fatias de diferentes "alturas", mostrando a raiz segmentado por RooTrak. (A - B): Fatia superior eo correspondente fatia da haste segmentada; (C - D): Fatia região centro e os correspondentes fatia de raiz segmentado; (E - F):. Fatia região inferior eo correspondente fatia de raiz segmentado Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5. isosuperfície da raiz como capturado a partir ImageJ. A superfície radicular foi aproximada por uma malha triangular. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Uma combinação de tomografia computadorizada por raios X e vários programas de código aberto provou ser uma combinação poderosa de forma não invasiva amostras de raízes de plantas imagem, dados de raiz segmento, e extrair informação quantitativa (área de superfície e volume) a partir dos dados 3D. A nossa capacidade para visualizar e medir características está sempre limitada pela resolução da digitalização, bem como por limitações do software RooTrak. No entanto, resolução de digitalização foi suficiente para capturar a maioria das características da amostra deste estudo, e RooTrak conseguiu com sucesso segmento de uma parcela significativa da raiz. A versão do RooTrak empregado neste trabalho não controlar segmentos de raiz de viagem para cima (para cima ramificação não estava presente de forma significativa na amostra estudada aqui); uma versão mais recente do programa aborda este problema 9.
Como sugerido na Introdução, uma pesquisa da literatura sugeriu que uma opção de software sem custos para calcular volume radiculare / área de superfície a partir de dados de tomografia 3D em espécimes na faixa centímetros e acima foi altamente desejável. O significado da abordagem aqui relatado é que, após a raiz é segmentada, que funciona com um formato de dados 3D criado pelo programa ImageJ amplamente utilizado. O coração da análise é o cálculo do volume e área de superfície da raiz a partir da sua imagem aproximada por uma malha triangular. A malha triangular gerado por ImageJ no formato .stl, é representado pelos índices dos triângulos que formam a superfície de aproximação. ImeshJ extrai os índices do formato de ficheiro binário e é capaz de calcular a área de superfície a partir dos índices (que é simplesmente metade da magnitude do produto cruzado entre vectores que une os pontos [1,2] e os pontos [1,3]). o volume é calculado através da construção de um tetraedro entre os pontos de triângulo e a origem, e encontrar o produto escalar triplo entre os vectores de posição do triângulo. Embora existam vários recursos para tais cálculos, o desafio foi calcular eficientemente a área superficial e o volume para malhas que continham mais de 10 milhões de triângulos (como pode ser o caso em estruturas de raiz maior). Ao eliminar estruturas em laço de código, o que iria processar os triângulos um por um, e implementação de vários métodos que permitem o processamento simultâneo de vários pontos de dados, fomos capazes de executar os cálculos sobre a 6 milhões de triângulo de malha em menos de 5 segundos. Com relação ao tamanho da amostra, um vaso de plantas em um recipiente de 20 onças iria cobrir toda a gama detector sob a mesma ampliação e resultaria em uma pilha de 2.000 fatia como conjunto de dados. Se extrapolarmos a velocidade do cálculo de uma pilha de 200 fatia de imagem (o tamanho da amostra da raiz processada neste estudo, 6,2 mm) processados em 5 segundos para uma pilha de 2.000 fatia, imeshJ ainda deve processar que menos de 1 min .
Os produtos deste método são a área da superfície eo volumeda amostra de raiz, que foram determinados sem remover a planta a partir do solo, ou perturbar de forma alguma. A área de superfície é calculada 351,87 milímetros 2, o volume é 47,27 milímetros 3. Outros, intermediários, os produtos são uma visualização 3D da estrutura de raiz, e a malha triangular das raízes (Figura 6).
Os passos críticos no presente protocolo é a imagiologia tomográfica não invasiva do espécime para fornecer dados com contraste de densidade suficiente (passo 1 no protocolo), a segmentação da porção de raiz do estudo a partir do resto da amostra (passo 3), e o cálculo do volume de raiz e a área de superfície da malha triangular, isosuperfície (passo 4). Para obter um contraste de densidade ideal, as configurações de energia de raios-X, 85 kV e 190 mA, foram escolhidos com base na resposta do detector para o presente da amostra; menor poder de raios-X teria produzido contraste de cor inferior, enquanto maior potência teria saturado o detector. O recurso de nível histograma cinza do software de coleta de dados orienta o usuário a decidir o que as configurações de energia para usar. Em geral, as amostras de solo de plantas com teor orgânico significativo tendem a exigir inferior (> 100 kV) ajustes de tensão de raio-X.
A precisão da área superficial calculada depende da suposição de que o produzido por isosuperfície ImageJ é uma aproximação razoável à superfície real da raiz. Esta suposição é razoável para grandes segmentos de raiz, mas pode ser menor por isso, quando raízes com dimensões comparáveis ao tamanho voxel são gravadas. Para a amostra neste estudo, o tamanho de toda a raiz e seus segmentos foram magnitudes maiores do que o tamanho do voxel. Os ImageJ default / configurações BoneJ (veja o parâmetro "Threshold" no 4.3 do Protocolo), resultando em 3,6x10 -4 mm 2 triângulos em relação ao 9.6x10 -4 mm 2 imagem tamanho do pixel deve ter fornecido uma estimativa precisa da raiz uma superfícierea. Para amostras com características menores que necessitam de maior detalhe, o número de triângulos que se aproximam da superfície pode ser aumentada (tamanho do triângulo diminuiu), diminuindo o valor "Threshold". Isto irá resultar em maior tempo de computação. Para segmentos de raiz com dimensões se aproximando do tamanho do voxel, a resolução instrumental se torna o gargalo, pois a representação voxel torna-se menos precisa. A precisão da figura volume calculado, também é dependente do pressuposto acima, mas a um grau menor, porque as raízes de menor diâmetro proporcionalmente menos contribuem para o volume da raiz do que a área da superfície da raiz. No entanto, uma secção transversal mais pequena da raiz podem ser digitalizados de forma igualmente eficaz se a distância a partir da fonte de raios-X é minimizado. Em outras palavras, os segmentos de raiz que requerem dados de resolução mais alta, teria de ser re-digitalizada com uma ampliação mais elevada, e pode ser obtido métricas mais precisos. A precisão do cálculo da área de superfície pode também serafectada por segmentação imperfeita da raiz do solo. Embora a capacidade de distinguir a raiz do solo depende da cor (nível de cinzento) contraste obtido no passo de imagiologia, melhoria da etapa de segmentação iria ajudar a reduzir qualquer erro no cálculo. Desenvolvimento de um novo código que iria melhorar o processo RooTrak segmentação está em andamento. O cálculo feito por imeshJ foi verificada comparando a saída do programa para espécimes simples, um único componente de volume conhecido e a área de superfície no nosso laboratório.
Esta metodologia de processamento de dados 3D devem ser aplicáveis a outros sistemas de material / amostra onde há conectividade entre os componentes de atenuação de raios-X semelhantes e dificuldades surgem com segmentação amostra. ImeshJ irá trabalhar com dados 3D a partir de qualquer fonte (PET, MRI) sobre qualquer objeto de interesse, enquanto uma pilha de imagens é criado a partir dos dados, que é usado para criar um isosurface, eo arquivo STLque imeshJ usa. Os valores da área e volume da superfície calculada deve ser comparado com os valores obtidos na mesma amostra por outros meios (a ser desenvolvido) para avaliar a precisão destes cálculos. Essa comparação será importante para a nossa capacidade de refinar ainda mais o código imeshJ. Os planos futuros incluem o desenvolvimento de uma nova ferramenta de acompanhamento de raiz eo código imeshJ para geração de imagens de alto rendimento de amostras de raízes de plantas.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| X-Tek/Metris XTH 320/225 kV | Nikon Metrology | X-ray tomography scanner | |
| Inspect X | Nikon Metrology | Instrument control software | |
| CT Pro 3D | Nikon Metrology | Reconstruction software, version XT 2.2 | |
| VG Studio MAX | Visual Graphics GmbH | Visualization software for 3D volumes, version 2.1.5 | |
| ImageJ | Open-source | Image processing and analysis software, version 1.6 | |
| RooTrak | Open-source | Root segmentation software, version 0.3.1-b1 beta | |
| imeshJ | EMSL | MATLAB script developed by the authors | |
| Prairie dropseed grass sample | Sample obtained from ground in residential area |
References
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