Визуализация пространственной реорганизацией МАРК сигнального пути с помощью переходного процесса система экспрессии Tobacco
Summary
At the subcellular level, signaling events are dynamically modulated by developmental and environmental cues. Here we describe a protocol that employs the tobacco transient expression system to monitor dynamic protein-protein interaction and to disclose spatial organization of signal transduction in plant cells.
Abstract
Визуализация динамических сигнальных событий в живых клетках было проблемой. Мы расширили установленную систему транзиторной экспрессии, биомолекулярной флуоресцентный комплементационная (BiFC) анализа в эпидермальных клеток табака, от взаимодействия тестирования белок-белок для контроля пространственного распределения сигналов в клетках растений. В этом протоколе, мы использовали пробу BiFC , чтобы показать , что взаимодействие и передача сигналов между Arabidopsis MAPKKK Йоду и MAPK6 происходит на плазматической мембране. Когда совместно высказывалось каркасный белок BASL, взаимодействие YODA-МАРК перераспределены и пространственно совместно с поляризованным CFP-BASL. Эта модифицированная система экспрессии табака позволяет быстро обследования сигнализации локализации и динамических изменений (менее 4-х дней) и может работать с несколькими флуоресцентных цветов белка (не менее трех). Мы также представили подробные методы для количественного определения распределения белка (асимметричную пространственную локализацию, или "поляризации";) В клетках табака. Эта усовершенствованная система экспрессии табака имеет потенциал, чтобы быть широко используется для быстрого тестирования динамических сигнальных событий в клетках живых растений.
Introduction
Белки взаимодействуют в запутанную иерархической сети и образуют комплексы, которые играют ключевую роль практически во всех биологических процессах, происходящих в непредсказуемом клеточной среде. Тем не менее, от развития растений в ответах роста, наблюдается отсутствие удобных инструментов, которые могут не только быстро, но и эффективно идентифицировать и контролировать эти динамические сигнализации событий на субклеточном уровне.
Переходная система экспрессии белка в табачных листьев эпидермис имеет привлекательный преимущества для визуализации флуоресцентных белков в живых клетках. Эта система обеспечивает условия полу- прижизненно, позволяющие посттрансляционной модификации белков и быстрое исследование локализации белка. Рассматривая дополненный сигнал YFP, бимолекулярный флуоресцентный комплементационная (BiFC) анализ информирует возможность взаимодействия белок-белок в клетках растений. По сравнению с другими методами, например, дрожжи-два гибридных (Y2H) и со-immunoprecipitation (Co-IP), BiFC также предоставляет мощные средства визуализации отсеков, где белок-белковые взаимодействия могут происходить на субклеточном уровне.
Поскольку асимметричное деление клеток (ДСА) поддерживает стволовые популяции клеток при создании новых типов клеток для формирования ткани / органа, он является незаменимым механизмом содействия эукариотической многоклеточность. Развитие Arabidopsis устичный была использована в качестве модельной системы для изучения ДСА в растениях. Клетка-предшественник, meristemoid материнские клетки, разрывами асимметрично, чтобы производить два разных дочерних клеток, а meristemoid (претерпевает стволовые клетки, как разделение, перед завершением на пару замыкающих клеток) и устичный родословная наземной клетки (SLGC) (может делиться и дифференцироваться в мостовая клетки), соответственно (рис 1). В устьичной ДСА, новый белок Преломление Асимметрия в Lineage УСТЬИЧНОГО (BASL) поляризован premitotically водить деление асимметрию, которая вклЛюд физическая асимметрия и клеточная судьба асимметрия 1. МАРК каскад , состоящий из MAPKKK Йоду и МАРК, MPK3 и 6 является центральным для формирования паттерна устичный деления и судьбы принятия 2,3, 4,5.
В последнее время , Zhang и др. связала полярности белка BASL к сигнального пути YDA-МАРК в Arabidopsis устьичной ДСА 6. Канонический YODA-МАРК путь, через MPK3 / 6, фосфорилирует BASL и активизирует свою поляризацию. Фосфорилированные BASL функционирует как помост и вербует Йоду (Yda) и MPK3 / 6 с образованием белкового комплекса и концентрировать сигнализацию на клетки коры головного мозга 6. Поляризационная компонентов МАРК и положительной обратной связи между BASL и пути YDA-МАРК представляет собой новый механизм поляризации белка в клетках растений. Локально обогащается сигнализации МАРК гипотетически быть тесно связана с судьбой клеток дифференциации в устьичной ДСА 6 (рисунок 1). Один из КEY экспериментальные данные , которые поддержали эту модель пришла от табака анализов , которые продемонстрировали пространственное перераспределение МАРК индуцированных выражением BASL 6.
В общем, это не так легко контролировать, где передача сигналов МАРК происходит потому, что молекулы МАРК часто встречаются повсеместно внутрь клетки. В данном исследовании мы использовали систему сплит-YFP визуализировать взаимодействие между вверх по течению и вниз по течению киназ те предположить, где происходит реле сигнализации. Кроме того, мы расширили использование системы BiFC путем коэкспрессирующей третий белок (CFP-меченый) с раздельным YFP пары (предполагающим белок-белкового взаимодействия), чтобы визуализировать ли и каким образом дополнены YFP может быть пространственно модулируют СО- выразил CFP белок. Поступая таким образом, мы показали, что совместное выражение CFP-BASL индуцированной пространственной реорганизации взаимодействий между Yda и MPK6, от равномерного распределения к поляризованной кучность в клеточной коре табака эпидермисаAl клетки. Таким образом , эта система имеет потенциал , чтобы быть разработаны для мониторинга динамических сигнальных событий в клетках растений в условиях , когда клетки сталкиваются с проблемой внутренних или внешних раздражителей (например, совместная экспрессия других белков, химического применения, атаки патогена или изменений в окружающей среде, и т.д.. ).
Protocol
Representative Results
Discussion
Общее использование и возможные модификации Преходящего системы Expression табака для передачи сигнала: гиперэкспрессия флуоресцентного белка (FP) -tagged белков в табаке эпидермиса успешно используется для быстрого изучения белка внутриклеточной локализации в клетках растений. Те?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Yumeng (Helen) Xia (Rutgers University) for manuscript editing. The work on BASL polarity formation is supported by grants from the U.S. National Institute of General Medical Sciences to J.D. (R01GM109080) and Rutgers University.
Materials
| Phusion DNA polymerase | New England Biolabs | M0530S | |
| pENTR/D/TOPO | Life Technologies | K2400-20 | |
| QuickChange II XL Site-directed Mutagenesis Kit | Agilent Technology | 200521 | |
| LB broth | AMRESCO | J106-2KG | |
| Bacto Agar | AMRESCO | J673-1KG | |
| Gentamycin | Sigma-Aldrich | G3632-1G | |
| Rifampicin | Sigma-Aldrich | R3501-1G | |
| Kanamycin | Sigma-Aldrich | K4000-25G | |
| Spectinomycin | Sigma-Aldrich | S4014-5G | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266-100G | |
| 25x75mm Slide | VWR | 16004-382 | |
| 24×50 mm Cover glass | VWR | 48393-241 | |
| Laser scanning confocal microscope | Leica | TCS SP5 II | LAS AF Lite software |
| 40 x objective lens | Leica | HCX Plan APO | HCX Plan APO , NA 1.30 |
| Centrifuge | Thermo Scientific | SORVALL 6+ | |
| Hole puncher | Staples | ||
| 50 ml falcon tubes | Genesee Scientific | 21-108 | |
| No. 5 Forceps | Canemco & Marivac | 205EQA-Spec |
References
- Dong, J., MacAlister, C. A., Bergmann, D. C. BASL controls asymmetric cell division in Arabidopsis. Cell. 137, 1320-1330 (2009).
- Lukowitz, W., Roeder, A., Parmenter, D., Somerville, C. A MAPKK kinase gene regulates extra-embryonic cell fate in Arabidopsis. Cell. 116, 109-119 (2004).
- Bergmann, D. C., Lukowitz, W., Somerville, C. R. Stomatal development and pattern controlled by a MAPKK kinase. Science. 304, 1494-1497 (2004).
- Lampard, G. R., Lukowitz, W., Ellis, B. E., Bergmann, D. C. Novel and expanded roles for MAPK signaling in Arabidopsis stomatal cell fate revealed by cell type-specific manipulations. Plant Cell. 21, 3506-3517 (2009).
- Wang, H., Ngwenyama, N., Liu, Y., Walker, J. C., Zhang, S. Stomatal development and patterning are regulated by environmentally responsive mitogen-activated protein kinases in Arabidopsis. Plant Cell. 19, 63-73 (2007).
- Zhang, Y., Wang, P., Shao, W., Zhu, J. K., Dong, J. The BASL Polarity Protein Controls a MAPK Signaling Feedback Loop in Asymmetric Cell Division. Dev Cell. 33, 136-149 (2015).
- Xu, R., Li, Q. Q. Protocol: Streamline cloning of genes into binary vectors in Agrobacterium via the Gateway(R) TOPO vector system. Plant methods. 4, 4 (2008).
- Bush, S. M., Krysan, P. J. Mutational evidence that the Arabidopsis MAP kinase MPK6 is involved in anther, inflorescence, and embryo development. J Exp Bot. 58, 2181-2191 (2007).
- Carey, M. F., Peterson, C. L., Smale, S. T. PCR-mediated site-directed mutagenesis. Cold Spring Harbor protocols. , 738-742 (2013).
- Kubo, M., et al. Transcription switches for protoxylem and metaxylem vessel formation. Genes Dev. 19, 1855-1860 (2005).
- Yuan, L., et al. Allosteric regulation of transport activity by heterotrimerization of Arabidopsis ammonium transporter complexes in vivo. Plant Cell. 25, 974-984 (2013).
- Weigel, D., Glazebrook, J. Transformation of agrobacterium using the freeze-thaw method. CSH protocols. 2006 (7), (2006).
- Voinnet, O., Rivas, S., Mestre, P., Baulcombe, D. An enhanced transient expression system in plants based on suppression of gene silencing by the p19 protein of tomato bushy stunt virus. Plant J. 33, 949-956 (2003).
- Rivero, L., et al. Handling Arabidopsis plants: growth, preservation of seeds, transformation, and genetic crosses. Methods in molecular biology. 1062, 3-25 (2014).
- Yang, Z. Cell polarity signaling in Arabidopsis. Annu Rev Cell Dev Biol. 24, 551-575 (2008).
- Zhang, J., Nodzynski, T., Pencik, A., Rolcik, J., Friml, J. PIN phosphorylation is sufficient to mediate PIN polarity and direct auxin transport. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 918-922 (2010).
- Furutani, M., et al. Polar-localized NPH3-like proteins regulate polarity and endocytosis of PIN-FORMED auxin efflux carriers. Development. 138, 2069-2078 (2011).
- Takano, J., et al. Polar localization and degradation of Arabidopsis boron transporters through distinct trafficking pathways. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 5220-5225 (2010).
- Truernit, E., Bauby, H., Belcram, K., Barthelemy, J., Palauqui, J. C. OCTOPUS, a polarly localised membrane-associated protein, regulates phloem differentiation entry in Arabidopsis thaliana. Development. 139, 1306-1315 (2012).
- Pillitteri, L. J., Peterson, K. M., Horst, R. J., Torii, K. U. Molecular profiling of stomatal meristemoids reveals new component of asymmetric cell division and commonalities among stem cell populations in Arabidopsis. Plant Cell. 23, 3260-3275 (2011).
- Mouchel, C. F., Osmont, K. S., Hardtke, C. S. BRX mediates feedback between brassinosteroid levels and auxin signalling in root growth. Nature. 443, 458-461 (2006).
