Tütün Geçici İfade Sisteminin Kullanılması bir MAPK sinyal yolu Mekansal Reorganizasyon Görüntüleme
Summary
At the subcellular level, signaling events are dynamically modulated by developmental and environmental cues. Here we describe a protocol that employs the tobacco transient expression system to monitor dynamic protein-protein interaction and to disclose spatial organization of signal transduction in plant cells.
Abstract
canlı hücrelerde dinamik sinyal olaylarının Görselleştirme bir meydan okuma olmuştur. Bu, bitki hücrelerinde sinyal transdüksiyonu uzaysal dağılımının izlenmesi için test protein-protein etkileşimi kurulu bir geçici ifade sisteminin tütün epidermal hücrelerinde biyomoleküler floresan tamamlama (BiFC) deneyi genişletilmiştir. Bu protokol, etkileşimi ve Arabidopsis MAPKKK Yoda ve MAPK6 arasındaki sinyal plazma membranında meydana göstermek için BiFC tahlili kullanılmıştır. çatgı proteini BASL birlikte ifade edildiğinde Yoda-MAPK etkileşimi dağıtılabilir ve mekansal CFP-BASL ile birlikte polarize. Bu modifiye tütün sentezleme sistemi lokalizasyonu ve dinamik değişiklikleri (az 4 gün) ve floresan protein renk (en az üç) çarpanı ağırlayacak sinyalizasyon hızlı inceleme için izin verir. Biz de protein dağılımı (asimetrik mekansal lokalizasyonu, ya da "kutuplaşma" ölçmek için ayrıntılı yöntemler sundu;), Tütün hücrelerinde. Bu gelişmiş tütün ifade sistemi, canlı bitki hücrelerinde dinamik sinyal olaylarının hızlı test için yaygın olarak kullanılan bir potansiyele sahiptir.
Introduction
Proteinler öngörülemeyen hücresel ortamda meydana gelen neredeyse tüm biyolojik süreçlerde önemli bir rol oynamaktadır karmaşık bir hiyerarşik ağ ve form kompleksleri içinde etkileşimde. Ancak, büyüme yanıtları bitki gelişiminden, sadece hızlı değil, aynı zamanda etkin bir şekilde hücre içi düzeyde bu dinamik sinyal olaylarını tespit etmek ve izlemek edemez uygun araçlardan bir eksikliği vardır.
Tütün yaprağı epidermis geçici protein sentezleme sistemi canlı hücrelerin floresan proteinleri görselleştirmek için avantajlar cazip gelmiştir. Bu sistem post-translasyonel protein modifikasyonu ve protein lokalizasyonu hızlı incelenmesine olanak yarı in vivo koşulları sağlar. tamamlanmaktadır YFP sinyal inceleyerek, bimoleküler flüoresan tamamlama (BiFC) deneyi, bitki hücrelerinde protein-protein etkileşimi olasılığı bildirir. Diğer yöntemler, örneğin, maya-iki hibrid (Y2H) ve CO ile karşılaştırıldığında-immunoprecipitation (Co-IP) BiFC, protein-protein etkileşimleri hücre içi seviyede oluşabilir bölmeleri görselleştirme güçlü bir yol temin etmektedir.
Asimetrik hücre bölünmesi (ACD) doku / organ oluşumu için yeni bir hücre tipleri oluştururken hücre popülasyonu kök tutar için, ökaryotik multicellularity teşvik etmek için vazgeçilmez bir mekanizmadır. Arabidopsis stoma gelişimi bitkilerde ACD çalışmak için bir model sistem olarak kullanılmıştır. öncü hücre, Meristemoid anne hücresi, asimetrik bölmek ve içine ayırt edebilir (ve bir stoma soy zemin hücre (SLGC) (bekçi hücreleri bir çift içine sonlandırmadan önce hücre benzeri bölünmeleri kök uğrar), bir Meristemoid iki farklı kızı hücreler üretmek için bölen bir kaldırım hücresi), sırasıyla (Şekil 1). stoma ACD olarak, Stoma Lineage içinde Asimetrisinin yeni protein Kırma (BASL) inc hangi bölünme asimetrilerini sürücü premitotically polarizelude fiziksel asimetri ve hücre kaderi asimetri 1. MAPKKK YODA ve MAPK, MPK3 ve 6 oluşan bir MAPK kaskad stoma bölümü desen ve kader kabulü 2,3, 4,5 için merkezi.
Son zamanlarda, Zhang ve diğ. ACD 6 stoma Arabidopsis YDA-MAPK sinyal yoluna polarite protein BASL bağlı. kanonik YODA-MAPK yolağı, MPK3 / 6'ya kadar, BASL fosforile ve kutuplaşma aktive eder. Fosforile BASL bir iskele olarak fonksiyonları ve YODA (YDA) ve MPK3 / 6 acemi bir protein kompleksi oluşturmak ve hücre korteks 6 da sinyalini konsantre. MAPK bileşenleri ve BASL ve YDA-MAPK yolağı arasındaki pozitif geri besleme döngüsü Polarizasyon bitki hücrelerinde protein kutuplaşma için yeni bir mekanizmayı temsil etmektedir. Yerel olarak zenginleştirilmiş MAPK sinyal yakından stoma ACD 6 hücre kaderi farklılaşma (Şekil 1) bağlantılı olduğu varsayılmaktadır. k birBu model desteklenen ey deneysel veriler BASL 6 ekspresyonu ile sebep olunan MAPK mekansal yeniden dağıtım gösterdi tütün tahlilleri geldi.
MAPK molekülleri genellikle hücrenin içine her bulunduğu için, MAPK sinyal meydana geldiği, genel olarak, takip etmek kolay değildir. Bu çalışmada, biz sinyal rölesi oluştuğu önermek yukarı kinaz ve aşağı olanlar arasındaki etkileşimi görselleştirmek için bölünmüş YFP sistemi kullanılmaktadır. Bu, ek olarak BiFC sisteminin kullanımı uzatılmış birlikte ifade (protein-protein etkileşimi göstermektedir) bölünmüş YFP çift üçüncü bir proteini (CFP-etiketli) tamamlanmaktadır YFP uzamsal CO- ile modüle edilebilir ve bunun nasıl görselleştirmek CFP proteini ifade etmiştir. Bu şekilde, Tütün Epiderm hücre kortekste polarize dokusuna da dağıtım YDA ve MPK6 arasındaki etkileşimlerin uzaysal yeniden düzenlenmesi neden CFP-BASL bu ko-ifadesini gösterdial hücreleri. Bu sistem, bu nedenle hücre dahili veya harici stimuli ile meydan zaman koşulları altında, bitki hücrelerinde, dinamik sinyal olaylarını izlenmesi için geliştirilecek bir potansiyele sahip (örneğin, başka proteinler, kimyasal uygulama, patojen saldırısı ya da çevresel değişiklikler, vb birlikte ifadesi. ).
Protocol
Representative Results
Discussion
Genel Kullanım ve sinyal iletimi için Tütün geçiş sentezleme sisteminin olası değişiklikler: floresan proteinin aşırı ekspresyonunu (FP) başarılı bir şekilde, bitki hücrelerinde protein hücre içi lokalizasyonu hızlı inceleme için kullanılmıştır Tütün epidermis proteinleri etiketli. Bununla birlikte, in planta protein kompleksi dinamik sinyal dağılımını incelemek komplike hücre içi ortamlarda, geçici protein-protein etkileşimi ve sinyal transdüksiyon etkinli…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Yumeng (Helen) Xia (Rutgers University) for manuscript editing. The work on BASL polarity formation is supported by grants from the U.S. National Institute of General Medical Sciences to J.D. (R01GM109080) and Rutgers University.
Materials
| Phusion DNA polymerase | New England Biolabs | M0530S | |
| pENTR/D/TOPO | Life Technologies | K2400-20 | |
| QuickChange II XL Site-directed Mutagenesis Kit | Agilent Technology | 200521 | |
| LB broth | AMRESCO | J106-2KG | |
| Bacto Agar | AMRESCO | J673-1KG | |
| Gentamycin | Sigma-Aldrich | G3632-1G | |
| Rifampicin | Sigma-Aldrich | R3501-1G | |
| Kanamycin | Sigma-Aldrich | K4000-25G | |
| Spectinomycin | Sigma-Aldrich | S4014-5G | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266-100G | |
| 25x75mm Slide | VWR | 16004-382 | |
| 24×50 mm Cover glass | VWR | 48393-241 | |
| Laser scanning confocal microscope | Leica | TCS SP5 II | LAS AF Lite software |
| 40 x objective lens | Leica | HCX Plan APO | HCX Plan APO , NA 1.30 |
| Centrifuge | Thermo Scientific | SORVALL 6+ | |
| Hole puncher | Staples | ||
| 50 ml falcon tubes | Genesee Scientific | 21-108 | |
| No. 5 Forceps | Canemco & Marivac | 205EQA-Spec |
References
- Dong, J., MacAlister, C. A., Bergmann, D. C. BASL controls asymmetric cell division in Arabidopsis. Cell. 137, 1320-1330 (2009).
- Lukowitz, W., Roeder, A., Parmenter, D., Somerville, C. A MAPKK kinase gene regulates extra-embryonic cell fate in Arabidopsis. Cell. 116, 109-119 (2004).
- Bergmann, D. C., Lukowitz, W., Somerville, C. R. Stomatal development and pattern controlled by a MAPKK kinase. Science. 304, 1494-1497 (2004).
- Lampard, G. R., Lukowitz, W., Ellis, B. E., Bergmann, D. C. Novel and expanded roles for MAPK signaling in Arabidopsis stomatal cell fate revealed by cell type-specific manipulations. Plant Cell. 21, 3506-3517 (2009).
- Wang, H., Ngwenyama, N., Liu, Y., Walker, J. C., Zhang, S. Stomatal development and patterning are regulated by environmentally responsive mitogen-activated protein kinases in Arabidopsis. Plant Cell. 19, 63-73 (2007).
- Zhang, Y., Wang, P., Shao, W., Zhu, J. K., Dong, J. The BASL Polarity Protein Controls a MAPK Signaling Feedback Loop in Asymmetric Cell Division. Dev Cell. 33, 136-149 (2015).
- Xu, R., Li, Q. Q. Protocol: Streamline cloning of genes into binary vectors in Agrobacterium via the Gateway(R) TOPO vector system. Plant methods. 4, 4 (2008).
- Bush, S. M., Krysan, P. J. Mutational evidence that the Arabidopsis MAP kinase MPK6 is involved in anther, inflorescence, and embryo development. J Exp Bot. 58, 2181-2191 (2007).
- Carey, M. F., Peterson, C. L., Smale, S. T. PCR-mediated site-directed mutagenesis. Cold Spring Harbor protocols. , 738-742 (2013).
- Kubo, M., et al. Transcription switches for protoxylem and metaxylem vessel formation. Genes Dev. 19, 1855-1860 (2005).
- Yuan, L., et al. Allosteric regulation of transport activity by heterotrimerization of Arabidopsis ammonium transporter complexes in vivo. Plant Cell. 25, 974-984 (2013).
- Weigel, D., Glazebrook, J. Transformation of agrobacterium using the freeze-thaw method. CSH protocols. 2006 (7), (2006).
- Voinnet, O., Rivas, S., Mestre, P., Baulcombe, D. An enhanced transient expression system in plants based on suppression of gene silencing by the p19 protein of tomato bushy stunt virus. Plant J. 33, 949-956 (2003).
- Rivero, L., et al. Handling Arabidopsis plants: growth, preservation of seeds, transformation, and genetic crosses. Methods in molecular biology. 1062, 3-25 (2014).
- Yang, Z. Cell polarity signaling in Arabidopsis. Annu Rev Cell Dev Biol. 24, 551-575 (2008).
- Zhang, J., Nodzynski, T., Pencik, A., Rolcik, J., Friml, J. PIN phosphorylation is sufficient to mediate PIN polarity and direct auxin transport. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 918-922 (2010).
- Furutani, M., et al. Polar-localized NPH3-like proteins regulate polarity and endocytosis of PIN-FORMED auxin efflux carriers. Development. 138, 2069-2078 (2011).
- Takano, J., et al. Polar localization and degradation of Arabidopsis boron transporters through distinct trafficking pathways. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 5220-5225 (2010).
- Truernit, E., Bauby, H., Belcram, K., Barthelemy, J., Palauqui, J. C. OCTOPUS, a polarly localised membrane-associated protein, regulates phloem differentiation entry in Arabidopsis thaliana. Development. 139, 1306-1315 (2012).
- Pillitteri, L. J., Peterson, K. M., Horst, R. J., Torii, K. U. Molecular profiling of stomatal meristemoids reveals new component of asymmetric cell division and commonalities among stem cell populations in Arabidopsis. Plant Cell. 23, 3260-3275 (2011).
- Mouchel, C. F., Osmont, K. S., Hardtke, C. S. BRX mediates feedback between brassinosteroid levels and auxin signalling in root growth. Nature. 443, 458-461 (2006).
