Imaging Spatial Omorganisering av et MAPK signalveien Bruke Tobacco Transient Expression System

Summary

At the subcellular level, signaling events are dynamically modulated by developmental and environmental cues. Here we describe a protocol that employs the tobacco transient expression system to monitor dynamic protein-protein interaction and to disclose spatial organization of signal transduction in plant cells.

Abstract

Visualisering av dynamiske signal hendelser i levende celler har vært en utfordring. Vi utvidet et etablert transient ekspresjonssystem, det biomolekylære fluorescerende komplemente (BiFC) assay i tobakk epidermale celler, fra forsøk protein-protein interaksjon for å overvåke romlig fordeling av signaltransduksjon i planteceller. I denne protokoll har vi brukt BiFC assay for å vise at interaksjonen og signaleringen mellom Arabidopsis MAPKKK YODAs og MAPK6 forekomme på plasmamembranen. Når scaffoldprotein BASL ble co-uttrykk, Yoda-MAPK interaksjon omfordeles og romlig co-polarisert med CFP-BASL. Denne modifiserte tobakk uttrykk system sørger for rask undersøkelse av signale lokalisering og dynamiske endringer (mindre enn 4 dager) og kan huse flere av fluorescerende protein farger (minst tre). Vi presenterte også detaljerte metoder for å kvantifisere protein distribusjon (asymmetrisk romlig lokalisering, eller "polarisering";) I tobakkceller. Denne avanserte tobakk uttrykk systemet har et potensial til å bli brukt mye for rask testing av dynamiske signal hendelser i levende planteceller.

Introduction

Proteiner samhandle innenfor en intrikat hierarkisk nettverk og danner komplekser som spiller en sentral rolle i nesten alle biologiske prosesser som skjer i en uforutsigbar mobilnettet miljø. Men fra anlegget utvikling til vekstresponser, har det vært en mangel på praktiske verktøy som kan ikke bare raskt, men også effektivt identifisere og overvåke disse dynamiske signal hendelser på den subcellulære nivå.

Den forbigående proteinekspresjon system i tobakksblad epidermis har tiltrekkende fordeler for visualisering av fluorescerende proteiner i levende celler. Dette systemet gir semi- in vivo forhold som gjør at post-translasjonell proteinmodifisering og rask undersøkelse av protein lokalisering. Ved å undersøke den suppleres YFP signal informerer bimolecular fluorescerende komplemente (BiFC) assay muligheten for protein-protein interaksjon i planteceller. Sammenlignet med andre metoder, for eksempel, gjær-to hybrid (Y2H) og co-immunoprecipitation (Co-IP), BiFC gir også et kraftig middel til å visualisere avdelinger der protein-protein interaksjoner kan oppstå på subcellulære nivå.

Fordi asymmetrisk celledeling (ACD) opprettholder stamcelle populasjon under generering av nye celletyper for vev / organ formasjonen, er det uunnværlig en mekanisme for å fremme eukaryot multicellularity. Arabidopsis stomatal utvikling har vært brukt som et modellsystem for å studere ACD i planter. Forløperen celle, meristemoid mor celle, skiller asymmetrisk for å fremstille to forskjellige datterceller, en meristemoid (gjennomgår stamcellelignende divisjoner før terminering inn i et par med skjermcellene) og en stomatal avstamning første celle (SLGC) (kan dele seg og differensiere i et fortau celle), henholdsvis (figur 1). I stomatal ACD, er romanen protein Breaking av Asymmetri i stomatal Lineage (BASL) polarisert premitotically å kjøre divisjon asymmetrier, som incLude fysisk asymmetri og celle skjebne asymmetri ^en. En MAPK kaskade sammensatt av MAPKKK YODA og MAPKs, MPK3 og 6 er sentral for stomatal divisjon mønster og skjebne adopsjon ^{2,3, 4,5.}

Nylig, Zhang et al. knyttet polariteten protein BASL til YDA-MAPK signalveien i Arabidopsis stomatal ACD ^6. Den kanoniske YODA-MAPK vei, gjennom MPK3 / 6, phosphorylates BASL og aktiverer sin polarisering. Fosforylerte BASL fungerer som et stillas og rekrutterer YODAs (YDA) og MPK3 / 6 for å danne et proteinkompleks og konsentrer signale på celle cortex ^6. Polarisering av MAPK komponenter og den positive feedback loop mellom BASL og YDA-MAPK vei representerer en ny mekanisme for protein polarisering i planteceller. Lokalt beriket MAPK signal er antatt å være nært knyttet til celle skjebne differensiering i stomatal ACD ⁶ (figur 1). En av de key eksperimentelle data som støtter denne modellen kom fra tobakks analyser som viste den romlige fordeling av MAPK indusert ved ekspresjon av BASL ^6.

Generelt er det ikke lett å overvåke hvor MAPK signalering skjer fordi MAPK-molekyler ble ofte funnet overalt inne i en celle. I denne studien, benyttet vi split-YFP system for å visualisere interaksjonen mellom oppstrøms og nedstrøms kinasen de til å foreslå hvor signaler relé inntreffer. Vi ytterligere utvidet bruk av BiFC system ved ko-uttrykker et tredje protein (CFP-merket) med splitten YFP paret (mulighet for protein-protein interaksjon) for å visualisere om og hvordan den suppleres YFP kan bli rommessig modulert av co- uttrykte CFP protein. Ved å gjøre dette, viste vi at samtidig uttrykk for CFP-BASL indusert romlig omorganisering av interaksjoner mellom YDA og MPK6, fra og med distribusjon til polarisert mønster på celle cortex av tobakk epidermal celler. Dette systemet har derfor potensial til å bli utviklet for å overvåke dynamiske signal hendelser i planteceller under forhold når cellene blir utfordret av interne eller eksterne stimuli (f.eks, co-uttrykk av andre proteiner, kjemiske søknad, patogen angripe eller miljømessige endringer, osv. ).

Protocol

1. Plasmid Construction Generer konstruksjonene ved kloning teknologi som tidligere beskrevet 1,6. Først bruker en high fidelity DNA polymerase med egnede primere for å forsterke de kodende sekvenser av BASL, YDA og MPK6 og sub-klone dem inn i inngangs vektorer. Finn detaljert protokoll i 7. For å generere de dominerende negative versjoner av (henholdsvis DNmpk6 8 og DNyda 4,) MPK6 og YDA, bruke oppføringen plasmidene MPK6 og YDA som mal og in…

Representative Results

For å forhindre celledød indusert av den hyperaktive MAPK-signalering, ble kinase inaktive versjoner av YDA (DNyda) og MPK6 (DNmpk6) som benyttes i koekspresjon analyse i tobakkcellene. Verken samspillet mellom DNyda og DNmpk6 avslørt av BiFC eller CFP-BASL selv generert ujevn fordeling mønster (figur 3A-B). Når imidlertid CFP-BASL ble innført i DNyda-DNmpk6 interaksjon paret, ble både CFP og YFP signaler videreformidles til en sterkt polarisert måte (fig…

Discussion

Generell bruk og mulige endringer i tobakks Transient Expression System for signaltransduksjon: Overuttrykte fluorescerende protein (FP) -tagged proteiner i tobakk epidermis har blitt brukt for rask undersøkelse av protein subcellulære lokalisering i planteceller. Men å studere dynamisk signaldistribusjon av proteinkompleks i planta er en utfordrende tema på grunn av kompliserte subcellulære sammenhenger, forbigående protein-protein interaksjon og signaltransduksjon hendelser. For å møt…

Materials

Phusion DNA polymerase	New England Biolabs	M0530S
pENTR/D/TOPO	Life Technologies	K2400-20
QuickChange II XL Site-directed Mutagenesis Kit	Agilent Technology	200521
LB broth	AMRESCO	J106-2KG
Bacto Agar	AMRESCO	J673-1KG
Gentamycin	Sigma-Aldrich	G3632-1G
Rifampicin	Sigma-Aldrich	R3501-1G
Kanamycin	Sigma-Aldrich	K4000-25G
Spectinomycin	Sigma-Aldrich	S4014-5G
MgCl2	Sigma-Aldrich	M8266-100G
25x75mm Slide	VWR	16004-382
24×50 mm Cover glass	VWR	48393-241
Laser scanning confocal microscope	Leica	TCS SP5 II	LAS AF Lite software
40 x objective lens	Leica	HCX Plan APO	HCX Plan APO , NA 1.30
Centrifuge	Thermo Scientific	SORVALL 6+
Hole puncher	Staples
50 ml falcon tubes	Genesee Scientific	21-108
No. 5 Forceps	Canemco & Marivac	205EQA-Spec