En Filter-baserede Surface Enhanced Raman Spektroskopiske Assay til Rapid detektering af kemiske forureninger

Summary

En fremgangsmåde til fremstilling og udførelse af filterbaseret overflade forstærket Raman spektroskopi (SERS) assay til detektering af kemiske forureninger (dvs. pesticid ferbam og antibiotisk ampicillin) præsenteres.

Introduction

Surface Raman spektroskopi (SERS) er en teknik, der kombinerer Raman spektroskopi med nanoteknologi. Intensiteten af Raman-spredning af analytter på ædle metalliske nano-overflader er øget væsentligt ved lokaliserede overfladeplasmonresonans. ¹ Sølv nanopartikler (Ag NPS) er langt de mest anvendte SERS substrater på grund af sin høje enhancement evne. ² Indtil nu er der blevet udviklet forskellige syntetiske metoder til Ag NP'er. ^3-6 Ag NP'er kan anvendes alene som effektive SERS-substrater, eller kombineret med andre materialer og strukturer, der kan forbedre dets følsomhed og / eller funktionalitet. ^7-11

SERS teknikker har vist stor evne til påvisning af forskellige spormængde forurenende stoffer i fødevarer og miljøprøver ¹² Traditionelt er der to almindelige måder til fremstilling af et SERS prøve:.. Opløsningsbaserede og substrat-baserede metoder ¹³ løsning baseret method bruger NP kolloider at blande med prøver. Derefter NP-analytkomplekset opsamles ved hjælp af centrifugering, og aflejres på en fast bærer til Raman måling efter tørring. Underlaget-baserede metode er normalt anvendes ved at deponere flere mikroliter flydende prøve på præfabrikerede fast underlag. ¹⁴ Men ingen af disse to metoder er effektive og anvendelige for en stor mængde af prøvevolumen. Adskillige modifikationer af SERS analyser overvandt de mængdemæssige begrænsninger, såsom integrationen af et filtersystem ^15-21 eller inkorporering af en mikrovæskeanordning. ^21-24 De ændrede SERS analyser har vist stor forbedring i følsomhed og gennemførlighed til overvågning af kemiske forureninger i store vandprøver.

Her demonstrerer vi detaljeret protokol af fabrikation og anvendelse af en sprøjte filter baseret SERS metode til at påvise spor mængde pesticider ferbam og antibiotisk ampicillin.

Protocol

1. Sølv Nanopartikel Synthesis ¹⁵

1. Opløs 18 mg sølvnitrat i 100 ml ultrarent vand (18,2 ΩU) og vortex i 5 sek.
2. Opløs 27 mg natriumcitratdihydrat i 1 ml vand og vortex i 5 sek.
3. Overføre alle den fremstillede sølvnitratopløsning til en konisk kolbe indeholdende en omrører og sætte kolben på en magnetisk varmeplade. Kolben opvarmes under kraftig omrøring med en omrøringshastighed på 700 rpm ved ~ 350 ° C (indstilling temperatur på pladen).
4. Når kogningen, straks tilføje alle de forberedte natriumcitratopløsning til den koniske kolbe, og overlade løsningen til at koge i yderligere 25 min, indtil opløsningen bliver grønlig brun, hvilket indikerer dannelsen af ​​Ag NP'er.
5. Kolben fjernes fra varmepladen og sætte det på en anden magnetisk plade (ikke varme) og rør O / N på samme omrøring hastighed ved RT, indtil blandingen når en stabil tilstand, med en konstant farve og tranfatterne. Brug en UV-vis spektrometer til bestemmelse af absorbansen af ​​de fremstillede Ag NP'er om nødvendigt.
6. Fortynd den endelige blanding med ultrarent vand til 100 ml.
7. Brug en Zetasizer at måle størrelsen af ​​Ag NP'er om nødvendigt ifølge fabrikantens protokol.
8. Overfør Ag kolloid til en forseglet beholder og beskytte den mod lys med aluminiumsfolie. Kolloidet kan opbevares i køleskab ved 4-7 ° C i 2 måneder, hvis nødvendigt.

2. Fremstilling af en SERS Active filtermembran

1. Opløs 2,92 g natriumchlorid (NaCl) i 100 ml vand for at lave en 50 mM NaCl-opløsning.
2. Der tilsættes 1 ml af 5 mM NaCl-opløsning i 1 ml af de fremstillede Ag NP'er og bland dem på en Mikserens i 10 minutter ved 20 omdrejninger i minuttet. Dette skridt er at samle de Ag nationale parlamenter i Ag nanoclusters.
3. Placer en filtermembran (PVDF, 0,1 pm porestørrelse) i en filterholder, som kan fastgøres til en sprøjte. Den mindre porestørrelse membran var found mere effektiv end den større porestørrelse membran (dvs. 0,22 um) i fældefangst Ag nanoclusters og producere konsekvente signaler.
4. Belastning 2 ml af den fremstillede Ag nanoclusters ind i sprøjten til filtrering. Sæt filterholderen på sprøjten og manuelt passere hele volumenet af Ag nanoclusters gennem membranen ved strømningshastighed på 1 dråbe / sek. Membranenhederne fælder Ag nanoclusters, danner en SERS-aktiv filtermembran.
5. Frigør filtermembranen fra filterholderen. Særlig forsigtighed er nødvendig, når du holder membranen på den ydre rand ved hjælp af en pincet til at sikre, at ingen skade på membranen. Lufttørre i ca. 3 minutter og sted membran på et objektglas.
6. Raman påvisning af SERS substrat
   1. Indstil Raman instrumentet til en 780 nm bølgelængde laser med en laser effekt på 5 mW, eksponeringstid på 1 sek og eksponering antal 2. Indstil den mikroskopiske mål til 10X. Sørg for, at målet om softwaren er indstillet i overensstemmelse hermed også. </ Li>
   2. Placer objektglasset med membranen oven på platformen af ​​Raman instrument og bruge mikroskopet til at fokusere på overfladen af ​​membranen.
   3. Tilfældigt vælge 8-10 pletter fra membranens overflade og instrumentet vil indsamle dem automatisk i rækkefølge. Åbne spektrale data i producentens software til analyse.

3. Anvendelse af SERS Active Filter System til Detect kemiske forureninger

1. Forbered en 10 ppb ferbam løsning.
   Advarsel: ferbam er meget svingende. Brug forholdsregler (respirator og beskyttelsesbriller), når der vejer det faste stof.
   1. Afvej 2 mg ferbam pulver og opløse den i 20 ml 50% acetonitril (10 ml acetonitril og 10 ml vand) for at gøre en stamopløsning (100 ppm). Vortex kolben i 30 sek.
   2. Der tages 1 ml med 100 ppm ferbam opløsning i et reagensglas, og der tilsættes 9 ml 50% acetonitril til at gøre en 10 ppm opløsning. Vortex rør til 5 sek.
   3. Tag 1 ml af10 ppm opløsning i et reagensglas, og der tilsættes 9 ml 50% acetonitril at lave en 1 ppm opløsning. Vortex rør til 5 sek.
   4. Tag 1 ml af 1 ppm opløsning i et reagensglas, og der tilsættes 9 ml 50% acetonitril at lave en 100 ppb opløsning. Vortex rør til 5 sek.
   5. Der tages 1 ml 100 ppb opløsning i et reagensglas, og der tilsættes 9 ml 50% acetonitril til at gøre en 10 ppb opløsning. Vortex rør til 5 sek.
2. Forbered en 1 ppm ampicillin løsning.
   1. Afvej 10 mg ampicillin pulver og opløse den i 100 ml vand for at lave en 100 ppm ampicillin opløsning. Vortex kolben i 30 sek.
   2. Der tages 1 ml med 100 ppm opløsning i et reagensglas, og der tilsættes 9 ml vand for at lave en 10 ppm ampicillin opløsning. Vortex rør til 5 sek.
   3. Tag 1 ml af 10 ppm opløsning i et reagensglas, og der tilsættes 9 ml vand for at lave en 1 ppm ampicillin opløsning. Vortex rør til 5 sek.
3. Sæt filtermembranen tilbage til filterholderen, med NP belagte side opad. </ Li>
4. Load 5 ml én prøve i en ny sprøjte og derefter fastgøre den til filterholder med en Ag belagt membran inde i.
5. Manuelt passere hele volumenet af prøven gennem membranen ved strømningshastighed på 1 dråbe / sek. Målmolekyler kan adsorberes og koncentreret på NPS belagt på filtermembranen.
6. Frigør filtermembran fra filterholderen, lufttørre i ca. 3 min og måle de signaler ved hjælp af Raman instrument under anvendelse af samme fremgangsmåde som beskrevet i trin 2.6.
7. Gentag trin 2,2 til 2,6 for at forberede en anden Ag-coatede membran og følge af trin 3.3 til påvisning af den anden prøve.

Representative Results

De vigtigste trin i dette forsøg er vist i det skematiske diagram (figur 1). Figur 2 vist betydningen at bruge den optimerede mængde AgNPs i membrancoatingen for at nå den maksimeret følsomhed. 1 ml Ag NP'er tilvejebringer det stærkeste signal ved brug ferbam, sammenlignet med 0,5 ml (utilstrækkelig coating) eller 2 ml (for meget coating).

Vi var i stand til at detektere ferbam ved 10 ppb-niveau og ampicillin ved 1 ppm med stor signalintensitet af den udviklede filterbaseret SERS assay (figur 1). SERS-spektrum af ferbam udviser distinkte karakteristiske toppe ved 10 ppb. Toppen ved 1.386 ^cm-1 er fra den blandede vibration af KN og C = S strækning, og symmetrisk _CH3 deformation. Toppen ved 1.516 ^cm-1 er associeret med _CH3 og CN strækning. Toppen ved 561 cm 25-27 Spektret af 1 ppm ampicillin blev også klart påvist. Toppen ved 1.594 ^cm-1 og 1.447 ^cm-1 er fra C = C strækning og _CH3 / _CH2 deformation henholdsvis. Den stærke top ved 1.001 ^cm-1 er fra benzenringen vibrationer. Toppen ved 852 ^cm-1 er forbundet med symmetrisk CNC stretching. ^28-29 Den eksperimentelle tid til at analysere en prøve, er mindre end 20 min, herunder fremstillingen af SERS-aktive filtermembran med præ-syntetiserede Ag NP'er.

Med stigende prøvevolumen, kan vi yderligere øge detektionsgrænsen, som vist i figur 4. Vi observerede en stigning af topintensitet ved øgning af prøvevolumen. Dette er fordelen af ​​filteret baseret metode som volumen kan justeres og detektionsgrænsen er også indstillelig.

ether.within-side = "1">
Figur 1. Et skematisk diagram af filter SERS assay. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2. SERS-spektre af 5 ml 100 ppb ferbam passerer gennem membranerne overtrukket med forskellige mængder af Ag NPs Fra top til bund:. 0,5 ml Ag kolloid med 0,5 ml NaCl, 1,0 ml Ag med 1,0 ml NaCl, 1,5 ml Ag med 1,5 ml NaCl, henholdsvis. klik her for at se en større version af dette tal.

91 / 53791fig3.jpg "/>
Figur 3. SERS spektre af ferbam og ampicillin på Ag nationale parlamenter coated filter membran Fra top til bund:. Kontrol over 50% acetonitril, 10 ppb ferbam, styring af vand, 1 ppm Ampicillin henholdsvis. Klik her for at se en større udgave af dette tal.

Figur 4. SERS spektre af forskellige mængder af 100 ppb ferbam på Ag nationale parlamenter belagt filter membran Fra top til bund:. 3 ml ferbam, 5 ml ferbam, 7 ml ferbam, 9 ml ferbam henholdsvis. Klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

En af de kritiske trin i denne protokol er Ag NP syntese, når ensartede Ag nationale parlamenter er nøglen til ensartede resultater. Opvarmningstiden og koncentrationerne af udgangsstoffer skal styres præcist. Den gennemsnitlige størrelse af dette AgNPs præparat er 80 nm, hvilket blev målt ved Zetasizer (data ikke vist). En anden afgørende skridt er saltet sammenlægning, hvor saltkoncentrationen og sammenlægning tid skal styres præcist. Desuden er valget af membranen er også kritisk, da membranen med en mindre porestørrelse blev fundet mere effektivt at fælde Ag nanoclusters. For det specielle membran anvendes i denne undersøgelse, er der en for- og bagside, hvor forsiden skal placeres i holderen til at forbinde sprøjten. Hvis den blev placeret ned, overtrækket var meget mindre effektivt. Undgå bobler, når de passerer gennem membranen er en anden nøgle til en vellykket belægning.

Til fejlfinding af denne analyse, følgende trinanbefales. Hvis der ikke registreres eller lille signal, kontrollere følgende årsager. Den vigtigste årsag kunne være Ag NP'er ikke aggregeres nok til at blive fanget i porerne i filtermembranen. Forøgelse af saltkoncentrationen og / eller inkubationstiden kan øge aggregering. Ellers kontrolleres det, at bagsiden af ​​filtermembranen vender opad, og at mængden eller koncentrationen af ​​prøve lastet på membranen ikke er for lav. Hvis signalet af målmolekylet er ikke konsekvent, kontrollere følgende årsager: størrelsesfordelingen af ​​de Ag NP'er kan være for brede eller NPS er ikke ligeligt fordelt på membranen, sandsynligvis på grund af for megen aggregering af NP'er eller for hurtigt passerer gennem membranen.

Sammenlignet med vores tidligere data om brug af Ag dendritter som SERS substrat, ^30-31 følsomhed dette filter-baserede SERS assay er meget højere på ferbam afsløring. Dette skyldes den fordel af filteret-baseret system, som kan strømme laRGE prøvemængde, således at flere analytmolekyler er koncentreret på SERS substrat. En anden fordel ved at anvende filter-baserede system over løsningen-baserede metode er nem betjening og fieldable måling, da ingen centrifugering er nødvendig for at indsamle de NP-analyt-komplekset. Begrænsningen ved denne metode er det kan ikke bruges til komplekse flydende matrixer såsom mælk direkte, da de komplekse komponenter kan blokere membranens porer. Forbehandling nødvendig for at fjerne interfererende komponenter inden de passerer membranen.

Sammenfattende demonstrerer vi en enkel og følsom filterbaseret SERS assay, som kunne anvendes til detektering af forurenende stoffer eller forfalskninger i flydende fødevarer matrix og miljøprøver. For yderligere at skubbe detektionsgrænsen, er der behov for optimering af parametre, såsom NP størrelser og beløb, saltkoncentration, prøvevolumen og instrument parametre.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ampicillin	Fisher Scientific	BP1760-5	N/A
Ferbam	Chem Service	N-11970-250MG	98+%
Silver nitrate	Sigma Aldrich	209139	99.0+%
Sodium citrate dehydrate	Sigma Aldrich	W302600	99+%
Sodium chloride	Sigma Aldrich	S7653	99.5+%
EMD Millipore Durapore PVDF Membrane Filters	Fisher Scientific	VVLP01300	0.10 µm Pore Size, hydrophilic
Polycarbonate Filter Holders	Cole-Parmer	EW-29550-40	13 mm diameter
Analog Vortex Mixer	Fisher Scientific	02-215-365	N/A
Nutating Mixers	Fisher Scientific	05-450-213	N/A
DXR Raman spectroscope	Thermo Scientific	IQLAADGABFFAHCMAPB	Laser power: 1 mW Exposure time: 5 sec