Tecnica a Target microiniezione per lo sviluppo<em> Xenopus</em> Kidney
Summary
Here, we present a protocol to use fate maps and lineage tracers to target injections into individual blastomeres that give rise to the kidney of Xenopus laevis embryos.
Abstract
Il rene embrionale di Xenopus laevis (rana), le pronephros, costituito da un unico nefrone, e può essere usato come modello per malattie renali. Embrioni di Xenopus sono grandi, sviluppano esternamente, e possono essere facilmente manipolati da microiniezione o procedure chirurgiche. Inoltre, le mappe destino sono stati stabiliti per i primi embrioni di Xenopus. microiniezione mirata nella blastomere individuo che alla fine darà origine a un organo o tessuto di interesse può essere usata per iperespressione selettivamente o abbattere l'espressione genica all'interno di questa regione ristretta, diminuendo gli effetti secondari nel resto dell'embrione in via di sviluppo. In questo protocollo, si descrive come utilizzare le mappe di Xenopus destino stabilito di indirizzare il sviluppo di Xenopus rene (i pronephros), tramite microiniezione in specifiche blastomeri di embrioni a 4 e 8 celle. Iniezione di traccianti lineage permette la verifica del targeting specifico dell'iniezione.Dopo gli embrioni si sono sviluppati a mettere in scena 38-40, tutto il montaggio immunostaining viene usato per visualizzare lo sviluppo pronephric, e il contributo da parte delle cellule mirati alle pronephros può essere valutata. La stessa tecnica può essere adattato per indirizzare altri tipi di tessuto oltre ai pronephros.
Introduction
Il rene embrionale di Xenopus, i pronephros, è un buon modello per lo studio dello sviluppo dei reni e le malattie. Gli embrioni sviluppano esternamente, sono di grandi dimensioni, può essere prodotto in grandi quantità, e sono facilmente manipolati tramite microiniezione o procedure chirurgiche. Inoltre, i geni che regolano lo sviluppo del rene nei mammiferi e anfibi sono conservati. Reni mammiferi progredire attraverso tre fasi: Pronefro, mesonefro e metanefro 1, mentre gli anfibi embrionali hanno un pronephros e anfibi adulti hanno una metanefro. L'unità di filtraggio di base di queste forme di rene è il nefrone, ed entrambi i mammiferi e gli anfibi richiedono la stessa cascate di segnalazione ed eventi induttivi di sottoporsi nefrogenesi 2, 3. Le pronephros Xenopus contiene un singolo nefrone composto da prossimale, intermedio, distale e collegamento tubuli, e un glomo (analogo al glomerulo mammiferi) 1, 4-6 (Figura 1 </strong>). Il singolo, grande nefrone presente nelle pronephros Xenopus lo rende adatto come un semplice modello per lo studio dei geni coinvolti nei processi di sviluppo renale e malattie.
Mappe cellulare destino sono stati stabiliti per i primi embrioni di Xenopus, e sono liberamente disponibili online all'indirizzo Xenbase 7-11. Qui, descriviamo una tecnica per microiniezione di rivelatori di derivazione per indirizzare le sviluppo pronephros Xenopus, anche se la stessa tecnica può essere adattato per indirizzare altri tessuti come il cuore o gli occhi. traccianti Lineage sono etichette (tra cui coloranti vitali, destrani fluorescente, enzimi istochimicamente rilevabili, e mRNA che codifica per proteine fluorescenti) che possono essere iniettati in un blastomero precoce, che permette la visualizzazione della progenie di cellule che durante lo sviluppo. Questo protocollo utilizza MEM-RFP mRNA, membrana codifica mirata proteina fluorescente rossa 12, come tracciante lignaggio. Il tecnico microiniezione miratoniche per i singoli blastomeri in embrioni di 4 e 8 celle qui descritti possono essere utilizzati per l'iniezione con morpholinos per abbattere l'espressione genica, o con l'RNA esogeno di iperespressione di un gene di interesse. Iniettando nella ventrale, blastomeri vegetale, in primo luogo i pronephros dell'embrione saranno mirati, lasciando i pronephros controlaterale come controllo dello sviluppo. Co-iniezione di un tracciante verifica che il blastomere corretto è stato iniettato, e mostra quali tessuti nell'embrione nasce dalla blastomero iniettato, verificando mira dei pronephros. Immunocolorazione dei pronephros permette la visualizzazione di come tubuli pronephric sono stati presi di mira. Sovraespressione e knockdown effetti possono essere ottenuti contro il lato controlaterale dell'embrione, che serve come controllo dello sviluppo, e possono essere utilizzati per calcolare l'indice pronephric 13. La disponibilità di mappe destino delle cellule permette questa tecnica microiniezione mirato da utilizzare per indirizzare i tessuti OTHer rispetto alle pronephros e co-iniezione di un tracciante fluorescente permette la microiniezione mirato per ciascun tessuto da verificare prima dell'analisi.
Durante embrione microiniezione, la temperatura di sviluppo dovrebbe essere regolata strettamente, dato che il tasso di sviluppo di Xenopus è fortemente dipendente su di esso 14. Gli embrioni devono essere incubate a temperature più fredde (14 – 16 ° C) per preparazioni iniettabili 4 e 8-cell, perché il tempo di sviluppo è rallentato. A 22 ° C, tempo di sviluppo dallo stadio 1 (1 cellula) alla fase 3 (4 celle) è di circa 2 ore, mentre a 16 ° C il tempo di sviluppo alla fase 3 è di circa 4 ore. Ci vogliono circa 15 minuti per andare da un embrione a 4 celle a 8 celle (fase 4) embrione a 22 ° C, ma richiede circa 30 minuti a 16 ° C. Allo stesso modo, a 22 ° C, ci vogliono solo 30 minuti per un embrione a 8 celle a progredire a un embrione di 16 cellule (fase 5). Questo tempo è aumentato a 45 minuti a 16 ° C. Ilto, è è utile a rallentare il tasso di sviluppo degli embrioni per consentire un tempo sufficiente per iniezioni nello stadio di 8 cellule prima gli embrioni passare alla fase 16 cellule. Inoltre, le temperature di crescita possono essere modulate per accelerare o rallentare lo sviluppo embrionale fino a quando il rene è completamente sviluppato.
L'epidermide di girino stadio Xenopus embrioni è relativamente trasparente, consentendo una facile l'imaging dei pronephros in via di sviluppo senza dissezione o compensazione del tessuto 15. A causa della relativa trasparenza di embrioni di Xenopus, l'imaging cellulare dal vivo è anche fattibile 16,17. Tutto il montaggio immunocolorazione per visualizzare le pronephros è possibile con anticorpi stabilito che etichettano prossimale, intermedio, distale e tubuli di collegamento della fase 38 – 40 embrioni che permettono di valutare lo sviluppo pronephric dopo la manipolazione dell'espressione genica mirata in Xenopus embrioni 18-20.
Protocol
Representative Results
Discussion
Targeting le pronephros di sviluppo di embrioni di Xenopus si basa sull'identificazione e iniettare la blastomeri corretta. L'iniezione del blastomero V2 di embrioni 8 celle obiettivi dei pronephros sinistra 18. Questo lascia i pronephros controlaterale destra come un controllo interno. Se morpholino knockdown o RNA sovraespressione è usato per alterare lo sviluppo del rene, i pronephros controlaterale destra possono essere utilizzati per confrontare gli effetti di knockdown gene o sovraespr…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto da un National Institutes of Health NIDDK concessione (K01DK092320) e il finanziamento di avvio del Dipartimento di Pediatria presso l'Università del Texas Medical School McGovern.
Materials
| Sodium chloride | Fisher | S271-3 | |
| Potassium chloride | Fisher | P217-500 | |
| Magnesium sulfate | Fisher | M63-500 | |
| Calcium chloride | Fisher | C79-500 | |
| HEPES | Fisher | BP310-500 | |
| EDTA | Fisher | S311-500 | |
| Gentamycin solution, 50 mg/mL | Amresco | E737-20ML | |
| L-Cysteine, 99%+ | Acros Organics | 52-90-4 | |
| Ficoll | Fisher | BP525-100 | |
| 100 mm x 15 mm Petri dish | Fisher | FB0875712 | |
| Mini Fridge II | Boekel | 260009 | Benchtop incubator for embryos. |
| Gap43-RFP plasmid | For making tracer RNA. Ref: Davidson et al., 2006. | ||
| Rhodamine dextran, 10,000 M.W. | Invitrogen | D1817 | Tracer. |
| Molecular biology grade, USP sterile purified water | Corning | 46-000-CI | |
| 7" Drummond replacement tubes | Drummond | 3-000-203-G/XL | Microinjection needles. |
| Needle puller | Sutter Instruments | P-30 | |
| Fine forceps | Dumont | 11252-30 | For breaking microinjection needle tip. |
| Nanoject II | Drummond | 3-000-204 | Microinjector. |
| Mineral oil, heavy | Fisher | CAS 8042-47-5 | Oil for needles. |
| 27G monoject hypodermic needle | Covidien | 8881200508 | For loading mineral oil into microinjection needle. |
| 5 mL Luer-Lok syringe | BD | 309646 | For loading mineral oil into microinjection needle. |
| 60 mm x 15 mm Petri dish | Fisher | FB0875713A | |
| 800 micron polyester mesh | Small Parts | CMY-0800-C | |
| Transfer pipets | Fisher | 13-711-7M | For transferring embryos. Cut off the tip so that the embryos are easily taken up by the pipette. |
| 6-well cell culture plate | Nest Biotechnology | ||
| MOPS | Fisher | BP308-500 | |
| EGTA | Acros Organics | 67-42-5 | |
| Formaldehyde | Fisher | BP531-500 | |
| 15 mm x 45 mm screw thread vial | Fisher | 03-339-25B | For fixing, staining, and storing embryos. |
| 24-well cell culture plate | Nest Biotechnology | ||
| Benzocaine | Spectrum | BE130 | |
| Ethanol | Fisher | BP2818-4 | |
| Methanol | Fisher | A412-4 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) 1X powder | Fisher | BP661-50 | |
| Bovine serum albumen | Fisher | BP1600-100 | |
| Triton X-100 | Fisher | BP151-500 | |
| 3D mini rocker, model 135 | Denville Scientific | 57281 | |
| Goat serum, New Zealand origin | Invitrogen | 16210064 | |
| Sodium azide | Fisher | S227I-25 | |
| Monoclonal 3G8 antibody | European Xenopus Resource Centre | Primary antibody to label proximal tubules. | |
| Monoclonal 4A6 antibody | European Xenopus Resource Centre | Primary antibody to label distal tubule and duct. | |
| anti-RFP pAb, purified IgG/rabbit | MBL | PM005 | Primary antibody to label Gap43-RFP tracer. |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG | Life Technologies | A11001 | Secondary antibody to label distal tubule and duct. |
| Alexa Fluor 555 goat anti-rabbit IgG | Life Technologies | A21428 | Secondary antibody to label Gap43-RFP tracer. |
| 9 cavity spot plate | Corning | 7220-85 | |
| Benzyl benzoate | Fisher | 105862500 | Optional – for clearing embryos |
| Benzyl alcohol | Fisher | A396-500 | Optional – for clearing embryos |
References
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