Teknikken til Target Mikroinjeksjon til utviklings<em> Xenopus</em> Nyre

Summary

Here, we present a protocol to use fate maps and lineage tracers to target injections into individual blastomeres that give rise to the kidney of Xenopus laevis embryos.

Abstract

Den embryoniske nyre fra Xenopus laevis (frosk), den pronephros, består av et enkelt nevronet, og kan brukes som en modell for nyresykdom. Xenopus embryoer er store, utvikle eksternt, og kan lett manipuleres ved mikroinjeksjon eller kirurgiske prosedyrer. I tillegg er det etablert skjebne kart for tidlig Xenopus embryo. Målrettet mikroinjeksjon inn i de enkelte blastomere som til slutt vil gi opphav til et organ eller vev av interesse kan bli brukt for selektivt å overuttrykke eller slå ned genekspresjon innenfor dette begrensede område, reduseres sekundære effekter på resten av utvikling av embryo. I denne protokollen beskriver vi hvordan du kan utnytte etablerte Xenopus skjebne kart å målrette utvikle Xenopus nyre (de pronephros), gjennom mikroinjeksjon inn i spesifikke blastomere av 4- og 8-cellers embryoer. Injeksjon av avstamning tracere tillater verifisering av den spesifikke målrettingen av injeksjonen.Etter embryo har utviklet for å iscenesette 38-40, hel-mount farging brukes til å visualisere pronephric utvikling, og bidraget av målrettede celler til pronephros kan vurderes. Den samme teknikken kan tilpasses for å målrette andre typer vev i tillegg til pronephros.

Introduction

Xenopus embryoniske nyre, de pronephros, er en god modell for å studere nyre utvikling og sykdom. Embryoene utvikle eksternt, er store i størrelse, kan fremstilles i stort antall, og kan lett manipuleres via mikroinjeksjon eller kirurgiske prosedyrer. I tillegg er de gener som regulerer nyre utvikling hos pattedyr og amfibier bevart. Pattedyr nyrene går gjennom tre stadier: de pronephros, mesonephros og metanephros ^1, mens embryonale amfibier har en pronephros og voksne amfibier har en metanephros. Den grunnleggende filtrering enhet av disse nyre formene er nevronet, og både pattedyr og amfibier krever de samme signalkaskader og induktive arrangementer for å gjennomgå nephrogenesis ^{to, tre.} Xenopus pronephros inneholder et enkelt nephron sammensatt av proksimale, middels, distal og kobler tubuli, og en glomus (analog til pattedyr glomerulus) ^{1, 4-6} (Figur 1 </strong>). Den eneste, stor nevronet tilstede i Xenopus pronephros gjør den egnet som en enkel modell for studiet av gener som er involvert i nyre utviklings- og sykdomsprosesser.

Cell skjebne kart er etablert for tidlig Xenopus embryo, og er fritt tilgjengelig online på Xenbase ^7-11. Her beskriver vi en teknikk for mikroinjeksjon av avstamning tracere å målrette utviklings Xenopus pronephros, selv om den samme teknikken kan tilpasses målrette andre vev som hjerte eller øynene. Linjesporstoff etiketter (inkludert vitale farvestoffer, fluorescerende merkede dekstraner, histochemically detekterbare enzymer, og mRNA som koder for fluorescerende proteiner) som kan injiseres inn i en tidlig blastomere, som tillater visualisering av avkommet av cellen i løpet av utviklingen. Denne protokollen benytter MEM-RFP mRNA, som koder for membran målrettet rød fluorescerende protein ^12, som en avstamning tracer. Den målrettede mikroinjeksjon techteknikker for individuelle blastomeres i 4- og 8-cellers embryo som er beskrevet her kan benyttes for injeksjon med morpholinos å slå ned genekspresjon, eller med eksogen RNA til overuttrykker et gen av interesse. Ved å injisere inn i ventral, vegetal blastomere, først og fremst pronephros av embryoet vil være målrettet, forlater kontralaterale pronephros som en utviklingsmessig kontroll. Samtidig injeksjon av en tracer bekrefter at riktig blastomere ble injisert, og viser hvilke vev i fosteret oppsto fra den injiserte blastomere, verifisere målretting av pronephros. Farging av pronephros tillater visualisering av hvor godt pronephric tubuli har vært målrettet. Overekspresjon og knockdown effekter kan deretter scoret mot motsatt side av embryoet, som fungerer som en utviklingsmessig kontroll, og kan brukes til å beregne pronephric indeksen ^13. Tilgjengeligheten av celle skjebne kartene tillater dette målrettet mikroinjeksjonsteknikk som kan brukes til å målrette vev klienEr enn pronephros, og co-injeksjon av et fluorescerende sporstoff gjør at målrettet mikroinjeksjon til hver vev som skal verifiseres før analyse.

Under embryo mikroinjeksjon, bør utviklings temperatur reguleres strengt, gitt at frekvensen av Xenopus utviklingen er svært avhengig av det ^14. Embryoet skal inkuberes ved kjøligere temperaturer (14-16 ° C) for 4- og 8-cellers injeksjoner fordi utviklingstiden er bremset ned. Ved 22 ° C, utviklingstiden fra trinn 1 (en celle) for å iscenesette 3 (4 celler) er ca 2 timer, mens ved 16 ° C utviklingstiden til scenen tre er ca 4 timer. Det tar ca 15 minutter å gå fra en 4-cellers embryo til en 8-cellers (stadium 4) embryo ved 22 ° C, men tar ca 30 minutter ved 16 ° C. Tilsvarende ved 22 ° C, det tar bare 30 minutter for en 8-cellers embryo for å utvikle seg til en 16-cellers embryo (trinn 5). Denne tiden økte til 45 minutter ved 16 ° C. Derefore, er det nyttig å bremse utviklingen til embryoene for å muliggjøre tilstrekkelig tid for injeksjon ved 8-cellestadiet før embryoene videre til 16-cellestadiet. I tillegg kan veksttemperaturer moduleres å fremskynde eller forsinke embryoutvikling til nyrene har fullt utviklet.

Epidermis av rumpetroll-trinns Xenopus embryo er relativt gjennomsiktig, noe som åpner for enkel bildebehandling av utviklings pronephros uten disseksjon eller clearing av vevet ^15. På grunn av den relative åpenhet av Xenopus embryo, er levende celle bildebehandling også mulig ^16,17. Hel-mount farging å visualisere de pronephros er mulig med etablerte antistoffer som merker den proksimale, middels, distal og kobler tubuli av scene 38 – 40 embryoer som gir mulighet for vurdering av pronephric utvikling etter målrettet manipulering av genuttrykk i Xenopus embryo ^18-20.

Protocol

Følgende protokoll er godkjent av University of Texas Health Science Center i Houston Center for Forsøksdyr Medicine Animal Welfare Committee, som fungerer som Institutional Care og bruk Committee (protokoll #: HSC-AWC-13-135). 1. Identifikasjon og utvelgelse av blastomeres for nyre-målrettet injeksjoner Før generere embryoer, bruker Normal Table of Xenopus Development 21 for å forstå retningen av de tidlige celledelinger i embryo. Alternativt tilgang diagrammer av de tidlige…

Representative Results

Microinjections av 4- og 8-cellers Xenopus embryoer med MEM-RFP mRNA viser ulike nivåer av målretting i pronephros. Figur 4 viser scene 40 embryoer med riktige MEM-RFP mRNA uttrykk mønstre. Embryoer ble injisert i den venstre ventrale blastomere (figur 4A), og sortert for den riktige uttrykk mønster av MEM-RFP mRNA. I tillegg til å uttrykke MEM-RFP i den proksimale, mellomliggende, distal og forbinder tubuli i nyrene, er riktig injiserte em…

Discussion

Rettet mot pronephros for å utvikle Xenopus embryo er avhengig av å identifisere og injisere riktig blastomere. Injeksjon av V2 blastomere av 8-cellers embryo rettet mot venstre pronephros ^18. Dette etterlater kontralaterale riktige pronephros som en intern kontroll. Hvis morfolino knockdown eller RNA overekspresjon brukes til å endre nyre utvikling, kan kontralaterale riktige pronephros brukes til å sammenligne effekten av genet knockdown eller overekspresjon til venstre pronephros. I dette tilf…

Materials

Sodium chloride	Fisher	S271-3
Potassium chloride	Fisher	P217-500
Magnesium sulfate	Fisher	M63-500
Calcium chloride	Fisher	C79-500
HEPES	Fisher	BP310-500
EDTA	Fisher	S311-500
Gentamycin solution, 50 mg/mL	Amresco	E737-20ML
L-Cysteine, 99%+	Acros Organics	52-90-4
Ficoll	Fisher	BP525-100
100 mm x 15 mm Petri dish	Fisher	FB0875712
Mini Fridge II	Boekel	260009	Benchtop incubator for embryos.
Gap43-RFP plasmid			For making tracer RNA. Ref: Davidson et al., 2006.
Rhodamine dextran, 10,000 M.W.	Invitrogen	D1817	Tracer.
Molecular biology grade, USP sterile purified water	Corning	46-000-CI
7" Drummond replacement tubes	Drummond	3-000-203-G/XL	Microinjection needles.
Needle puller	Sutter Instruments	P-30
Fine forceps	Dumont	11252-30	For breaking microinjection needle tip.
Nanoject II	Drummond	3-000-204	Microinjector.
Mineral oil, heavy	Fisher	CAS 8042-47-5	Oil for needles.
27G monoject hypodermic needle	Covidien	8881200508	For loading mineral oil into microinjection needle.
5 mL Luer-Lok syringe	BD	309646	For loading mineral oil into microinjection needle.
60 mm x 15 mm Petri dish	Fisher	FB0875713A
800 micron polyester mesh	Small Parts	CMY-0800-C
Transfer pipets	Fisher	13-711-7M	For transferring embryos. Cut off the tip so that the embryos are easily taken up by the pipette.
6-well cell culture plate	Nest Biotechnology
MOPS	Fisher	BP308-500
EGTA	Acros Organics	67-42-5
Formaldehyde	Fisher	BP531-500
15 mm x 45 mm screw thread vial	Fisher	03-339-25B	For fixing, staining, and storing embryos.
24-well cell culture plate	Nest Biotechnology
Benzocaine	Spectrum	BE130
Ethanol	Fisher	BP2818-4
Methanol	Fisher	A412-4
Phosphate buffered saline (PBS) 1X powder	Fisher	BP661-50
Bovine serum albumen	Fisher	BP1600-100
Triton X-100	Fisher	BP151-500
3D mini rocker, model 135	Denville Scientific	57281
Goat serum, New Zealand origin	Invitrogen	16210064
Sodium azide	Fisher	S227I-25
Monoclonal 3G8 antibody	European Xenopus Resource Centre		Primary antibody to label proximal tubules.
Monoclonal 4A6 antibody	European Xenopus Resource Centre		Primary antibody to label distal tubule and duct.
anti-RFP pAb, purified IgG/rabbit	MBL	PM005	Primary antibody to label Gap43-RFP tracer.
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG	Life Technologies	A11001	Secondary antibody to label distal tubule and duct.
Alexa Fluor 555 goat anti-rabbit IgG	Life Technologies	A21428	Secondary antibody to label Gap43-RFP tracer.
9 cavity spot plate	Corning	7220-85
Benzyl benzoate	Fisher	105862500	Optional – for clearing embryos
Benzyl alcohol	Fisher	A396-500	Optional – for clearing embryos