Teknik till Target mikroinjektion till utvecklings<em> Xenopus</em> Njure
Summary
Here, we present a protocol to use fate maps and lineage tracers to target injections into individual blastomeres that give rise to the kidney of Xenopus laevis embryos.
Abstract
Den embryonala njure av Xenopus laevis (groda), de pronephros, består av en enda nefronet, och kan användas som en modell för njursjukdom. Xenopus embryon är stora, utveckla externt, och kan lätt manipuleras genom mikroinjektion eller kirurgiska ingrepp. Dessutom har ödet kartor etablerats för tidiga Xenopus embryon. Riktade mikroinjektion i den individuella blastomere som så småningom kommer att ge upphov till ett organ eller vävnad av intresse kan användas för att selektivt överuttrycker eller riva genuttryck inom detta begränsade område, minskar sekundära effekter i resten av det växande embryot. I detta protokoll, beskriver vi hur man använder etablerade Xenopus öde kartor för att rikta utvecklings Xenopus njure (de pronephros), genom mikroinjektion i specifik blastomer av embryon 4- och 8-cells. Injektion av linjespår tillåter kontroll av särskild inriktning på injektionen.Efter embryon har utvecklats till steg 38-40, hela montering immunfärgning används för att visualisera pronephric utveckling, och kan bedömas bidraget från målceller till pronephros. Samma teknik kan anpassas för att rikta andra vävnadstyper utöver de pronephros.
Introduction
Xenopus embryonjur, de pronephros, är en bra modell för att studera njur utveckling och sjukdom. Embryona utvecklas externt, är stora i storlek, kan produceras i stort antal, och kan lätt manipuleras genom mikroinjektion eller kirurgiska förfaranden. Dessutom är de gener som reglerar njurutveckling hos däggdjur och amfibier konserverade. Däggdjurs njurar framsteg genom tre stadier: de pronephros, mesonephros och metanefros 1, medan embryonala groddjur har en pronephros och vuxna amfibier har en metanefros. Den grundläggande filtreringsenhet av dessa njurformer är nefronet, och båda däggdjur och amfibier kräver samma signaleringskaskader och induktiva händelser genomgå nephrogenesis 2, 3. Xenopus pronephros innehåller en enda nefronet består av proximal, mellan-, distala och anslutande tubuli, och en glomus (analogt med däggdjurs glomerulus) 1, 4-6 (figur 1 </strong>). Den enda stora nephron närvarande i Xenopus pronephros gör den lämplig som en enkel modell för studier av gener som är involverade i njur utvecklings- och sjukdomsprocesser.
Cell öde kartor har fastställts för början av Xenopus embryon, och är fritt tillgängliga online på Xenbase 7-11. Här beskriver vi en teknik för mikroinjektion av linjespårämnen att rikta utvecklings Xenopus pronephros, även om samma teknik kan anpassas för att rikta andra vävnader såsom hjärtat eller ögon. Härstamning spår är etiketter (inklusive vitala färgämnen, fluorescerande dextraner, histokemiskt detekterbara enzymer, och mRNA som kodar fluorescerande proteiner) som kan injiceras i ett tidigt blastomere, vilket gör visualisering av avkomman av denna cell under utveckling. Detta protokoll använder MEM-RFP mRNA, som kodar för membran riktade röd fluorescerande protein 12, som en härstamning spårämne. Den riktade mikroinjektion techker för enskilda blastomeres i embryon 4- och 8-cells som beskrivs här kan användas för injektion med morpholinos att slå ner genuttryck, eller med exogen RNA att överuttrycker en gen av intresse. Genom att injicera in i ventrala, vegetabiliskt blastomere, i första hand pronephros av embryot kommer att riktas, lämnar kontra pronephros som en utvecklingskontroll. Samtidig injektion av ett spår verifierar att rätt blastomere injicerades, och visar vilka vävnader i embryot uppstod från det injicerade blastomere, kontrollera inriktning av pronephros. Immunfärgning av pronephros möjliggör visualisering av hur väl pronephric tubuli har riktats. Överuttryck och knockdown effekter kan sedan scored mot kontralaterala sidan av embryot, som tjänar som en utvecklingskontroll, och kan användas för att beräkna den pronephric index 13. Tillgängligheten av cellernas öde kartor medger denna riktad mikroinjektion teknik som skall användas för att målsöka vävnader other än pronephros, samt co-injektion av ett fluorescerande spårämne tillåter riktad mikroinjektion till varje vävnad som ska kontrolleras före analys.
Under embryomikroinjektion, bör utvecklings temperatur regleras tätt, med tanke på att graden av Xenopus utveckling är i hög grad beroende på det 14. Embryon bör inkuberas vid kallare temperaturer (14-16 ° C) i stället för 4- och 8-cellinjektioner eftersom utvecklingstiden är långsammare. Vid 22 ° C, utvecklingstid från steg 1 (en cell) till steg 3 (4 celler) är cirka 2 timmar, medan vid 16 ° C utvecklingstiden till steg 3 är cirka fyra timmar. Det tar ca 15 minuter för att gå från ett 4-cells embryo till en 8-cell (stadium 4) embryo vid 22 ° C, men tar cirka 30 minuter vid 16 ° C. På liknande sätt, vid 22 ° C, tar det bara 30 minuter för en 8-cell embryo att utvecklas till en 16-cell-embryot (etapp 5). Denna tid ökas till 45 minuter vid 16 ° C. Derefore, är det användbart att sakta ned utvecklingen hastigheten av embryona för att möjliggöra tillräckligt med tid för injektioner på 8-cellstadiet innan embryona vidare till 16-cellstadiet. Dessutom kan tillväxttemperaturer moduleras för att påskynda eller fördembryoutveckling tills njuren har fullt utvecklad.
Epidermis hos grodyngel skede Xenopus embryon är relativt öppen, vilket möjliggör enkel avbildning av utvecklings pronephros utan dissektion eller röjning av vävnaden 15. På grund av den relativa öppenheten i Xenopus embryon, är levande cell imaging också möjligt 16,17. Hela montering immunfärgning att visualisera pronephros är möjligt med etablerade antikroppar som märka den proximala, mellanliggande, distala och anslutande kanalerna i steg 38 – 40 embryon som möjliggör bedömning av pronephric utveckling efter riktad manipulation av genuttryck i Xenopus embryon 18-20.
Protocol
Representative Results
Discussion
Targeting pronephros att utveckla Xenopus embryon bygger på att identifiera och injicera rätt blastomere. Injektion av V2 blastomere av embryon 8-cells riktar vänster pronephros 18. Detta lämnar kontra rätt pronephros som en intern kontroll. Om morfolino knockdown eller RNA överuttryck används för att ändra njure utveckling, kan de kontralaterala högra pronephros användas för att jämföra effekterna av genen knockdown eller överuttryck på vänster pronephros. I detta fall bör ordentli…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av en National Institutes of Health NIDDK bidrag (K01DK092320) och start finansiering från Department of Pediatrics vid University of Texas McGovern Medical School.
Materials
| Sodium chloride | Fisher | S271-3 | |
| Potassium chloride | Fisher | P217-500 | |
| Magnesium sulfate | Fisher | M63-500 | |
| Calcium chloride | Fisher | C79-500 | |
| HEPES | Fisher | BP310-500 | |
| EDTA | Fisher | S311-500 | |
| Gentamycin solution, 50 mg/mL | Amresco | E737-20ML | |
| L-Cysteine, 99%+ | Acros Organics | 52-90-4 | |
| Ficoll | Fisher | BP525-100 | |
| 100 mm x 15 mm Petri dish | Fisher | FB0875712 | |
| Mini Fridge II | Boekel | 260009 | Benchtop incubator for embryos. |
| Gap43-RFP plasmid | For making tracer RNA. Ref: Davidson et al., 2006. | ||
| Rhodamine dextran, 10,000 M.W. | Invitrogen | D1817 | Tracer. |
| Molecular biology grade, USP sterile purified water | Corning | 46-000-CI | |
| 7" Drummond replacement tubes | Drummond | 3-000-203-G/XL | Microinjection needles. |
| Needle puller | Sutter Instruments | P-30 | |
| Fine forceps | Dumont | 11252-30 | For breaking microinjection needle tip. |
| Nanoject II | Drummond | 3-000-204 | Microinjector. |
| Mineral oil, heavy | Fisher | CAS 8042-47-5 | Oil for needles. |
| 27G monoject hypodermic needle | Covidien | 8881200508 | For loading mineral oil into microinjection needle. |
| 5 mL Luer-Lok syringe | BD | 309646 | For loading mineral oil into microinjection needle. |
| 60 mm x 15 mm Petri dish | Fisher | FB0875713A | |
| 800 micron polyester mesh | Small Parts | CMY-0800-C | |
| Transfer pipets | Fisher | 13-711-7M | For transferring embryos. Cut off the tip so that the embryos are easily taken up by the pipette. |
| 6-well cell culture plate | Nest Biotechnology | ||
| MOPS | Fisher | BP308-500 | |
| EGTA | Acros Organics | 67-42-5 | |
| Formaldehyde | Fisher | BP531-500 | |
| 15 mm x 45 mm screw thread vial | Fisher | 03-339-25B | For fixing, staining, and storing embryos. |
| 24-well cell culture plate | Nest Biotechnology | ||
| Benzocaine | Spectrum | BE130 | |
| Ethanol | Fisher | BP2818-4 | |
| Methanol | Fisher | A412-4 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) 1X powder | Fisher | BP661-50 | |
| Bovine serum albumen | Fisher | BP1600-100 | |
| Triton X-100 | Fisher | BP151-500 | |
| 3D mini rocker, model 135 | Denville Scientific | 57281 | |
| Goat serum, New Zealand origin | Invitrogen | 16210064 | |
| Sodium azide | Fisher | S227I-25 | |
| Monoclonal 3G8 antibody | European Xenopus Resource Centre | Primary antibody to label proximal tubules. | |
| Monoclonal 4A6 antibody | European Xenopus Resource Centre | Primary antibody to label distal tubule and duct. | |
| anti-RFP pAb, purified IgG/rabbit | MBL | PM005 | Primary antibody to label Gap43-RFP tracer. |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG | Life Technologies | A11001 | Secondary antibody to label distal tubule and duct. |
| Alexa Fluor 555 goat anti-rabbit IgG | Life Technologies | A21428 | Secondary antibody to label Gap43-RFP tracer. |
| 9 cavity spot plate | Corning | 7220-85 | |
| Benzyl benzoate | Fisher | 105862500 | Optional – for clearing embryos |
| Benzyl alcohol | Fisher | A396-500 | Optional – for clearing embryos |
References
- Vize, P. D., Seufert, D. W., Carroll, T. J., Wallingford, J. B. Model systems for the study of kidney development: Use of the pronephros in the analysis of organ induction and patterning. Dev. Biol. 188 (2), 189-204 (1997).
- Brandli, A. W. Towards a molecular anatomy of the Xenopus pronephric kidney. Int. J. Dev. Biol. 43 (5), 381-395 (1999).
- Hensey, C., Dolan, V., Brady, H. R. The Xenopus pronephros as a model system for the study of kidney development and pathophysiology. Nephrol. Dial. Transplant. 17, 73-74 (2002).
- Carroll, T., Vize, P. D. Synergism between Pax-8 and lim-1 in embryonic kidney development. Dev. Biol. 214 (1), 46-59 (1999).
- Zhou, X., Vize, P. D. Proximo-distal specialization of epithelial transport processes within the Xenopus pronephric tubules. Dev. Biol. 271 (2), 322-338 (2004).
- Raciti, D., et al. Organization of the pronephric kidney revealed by large-scale gene expression mapping. Genome Biol. 9 (5), 84 (2008).
- Moody, S. A., Kline, M. J. Segregation of fate during cleavage of frog (Xenopus laevis) blastomeres. Anat. Embryol. Berl. 182 (4), 347-362 (1990).
- Moody, S. A. Fates of the blastomeres of the 16-cell stage of Xenopus embryo. Dev. Biol. 119 (2), 560-578 (1987).
- Moody, S. A. Fates of the blastomeres of the 32-cell stage of Xenopus embryo. Dev. Biol. 122 (2), 300-319 (1987).
- Bauer, D. V., Huang, S., Moody, S. A. The cleavage stage origin of Spemann’s Organizer: Analysis of the movements of blastomere clones before and during gastrulation in Xenopus. Dev. 120 (5), 1179-1189 (1994).
- Karpinka, J. B., et al. Xenbase, the Xenopus model organism database; new virtualized system, data types and genomes. Nucleic Acids Res. 43, 756-763 (2015).
- Davidson, L. A., Marsden, M., Keller, R., Desimone, D. W. Integrin alpha5beta1 and fibronectin regulate polarized cell protrusions required for Xenopus convergence and extension. Curr. Biol. 16 (9), 833-844 (2006).
- Wallingford, J. B., Carroll, T. J., Vize, P. D. Precocious expression of the Wilms’ tumor gene xWT1 inhibits embryonic kidney development in Xenopus laevis. Dev. Biol. 202, 103-112 (1998).
- Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. . Early Development of Xenopus laevis. A Laboratory Manual. , (2000).
- Miller, R. K., Lee, M., McCrea, P. D., Kloc, M., Kubiak, J. Z. The Xenopus pronephros: A kidney model making leaps toward understanding tubule development. Xenopus Development. , 215-238 (2014).
- Lienkamp, S. S., et al. Vertebrate kidney tubules elongate using a planar cell polarity-dependent rosette-based mechanism of convergent extension. Nat. Genet. 44 (12), 1382-1387 (2012).
- Lyons, J. P., et al. Requirement of Wnt/β-catenin signaling in pronephric kidney development. Mech. Dev. 126 (3-4), 142-159 (2009).
- Miller, R. K., et al. Pronephric tubulogenesis requires Daam1-mediated planar cell polarity signaling. J. Am. Soc. Nephrol. 22, 1654-1667 (2011).
- Vize, P. D., Jones, E. A., Pfister, R. Development of the Xenopus pronephric system. Dev. Biol. 171 (2), 531-540 (1995).
- Miller, R. K., Lee, M., McCrea, P. D., Kloc, M., Kubiak, J. Z. Chapter 12: The Xenopus Pronephros: A Kidney Model Making Leaps toward Understanding Tubule Development. Xenopus Development. , (2014).
- Taira, M., Otani, H., Jamrich, M., Dawid, I. B. Expression of the LIM class homeobox gene Xlim-1 in pronephros and CNS cell lineages of Xenopus embryos is affected by retinoic acid and exogastrulation. Development. 120, 1525-1536 (1994).
- Weber, H., et al. Regulation and function of the tissue-specific transcription factor HNF1 alpha (LFB1) during Xenopus development. Int. Dev. Biol. 40 (1), 297-304 (1996).
- Carroll, T. J., Vize, P. D. Synergism between Pax-8 and lim-1 in embryonic kidney development. Dev. Biol. 214 (1), 46-59 (1999).
- Etkin, L. D., Pearman, B., Ansah-Yiadom, R. Replication of injected DNA templates in Xenopus embryos. Exp. Cell Res. 169 (2), 468-477 (1987).
- Vize, P. D. The chloride conductance channel ClC-K is a specific marker for the Xenopus pronephric distal tubule and duct. Gene Expr. Patterns. 3 (3), 347-350 (2003).
- Uochi, T. S., Takahashi, S., Ninomiya, H., Fukui, A., Asashima, M. The Na+, K+-ATPase alpha subunit requires gastrulation in the Xenopus embryo. Dev. Growth Differ. 39 (5), 571-580 (1997).
- Nieuwkoop, P. D., Faber, J. . Normal table of Xenopus laevis (Daudin): A systematical & chronological survey of the development from the fertilized egg till the end of metamorphosis. , (1994).
- Ubbels, G. A., Hara, K., Koster, C. H., Kirschner, M. W. Evidence for a functional role of the cytoskeleton in determination of the dorsoventral axis in Xenopus laevis eggs. J. Embryol. Exp. Morphol. 77, 15-37 (1983).
- Huang, S., Johnson, K. E., Wang, H. Z. Blastomeres show differential fate changes in 8-cell Xenopus laevis embryos that are rotated 90 degrees before the first cleavage. Dev. Growth Differ. 40 (2), 189-198 (1998).
- Colman, A., Drummond, D. The stability and movement of mRNA in Xenopus oocytes and embryos. J. Embryol. Exp. Morph. 97, 197-209 (1986).
