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Neuroscience

Determinação dos fotorreceptores celular Sensibilidade espectral em um inseto modelo de<em> In Vivo</em> Gravações intracelulares

Published: February 26, 2016
doi:
10.3791/53829
, ,
1Department of Ecology and Evolutionary Biology,University of California, Irvine, 2School of Life Sciences,University of Sussex

Summary

A técnica eletrofisiológica da gravação intracelular é demonstrado e usado para determinar sensibilidades espectrais de células fotorreceptoras único no olho composto de uma borboleta.

Abstract

gravação intracelular é uma técnica poderosa usada para determinar a forma como uma única célula podem responder a um dado estímulo. Na pesquisa visão, a gravação intracelular tem sido historicamente uma técnica comum usada para estudar as sensibilidades de células fotorreceptoras individuais a diferentes estímulos luminosos que ainda está sendo usado hoje. No entanto, continua a existir uma carência de metodologia detalhada na literatura para os investigadores que desejam replicar experiências de gravação intracelulares no olho. Aqui nós apresentamos o inseto como um modelo para examinar a fisiologia do olho em geral. células fotorreceptoras de insectos estão localizados perto da superfície do olho e são, portanto, fácil de alcançar, e muitos dos mecanismos envolvidos na visão são conservadas entre filos animais. Nós descrevemos o procedimento básico para in vivo de gravação intracelular de células fotorreceptoras no olho de uma borboleta, com o objetivo de tornar esta técnica mais acessível a pesquisadores com pouca experiência anterior em electrophysiology. Introduzimos o equipamento básico necessário, como preparar uma borboleta vivo para o registo, o modo de inserir um microeléctrodo de vidro em uma única célula, e, finalmente, o processo de gravação em si. Nós também explicar a análise básica de dados de resposta matérias para determinar sensibilidade espectral de tipos de células individuais. Embora o protocolo centra-se na determinação da sensibilidade espectral, outros estímulos (por exemplo, luz polarizada) e variações do método são aplicáveis ​​a esta configuração.

Introduction

As propriedades eléctricas de células tais como neurónios são observadas através da medição do fluxo de iões através das membranas celulares, como uma mudança na tensão ou corrente. Uma variedade de técnicas electrofisiológicas foram desenvolvidos para medir bioeléctico eventos em células. Os neurónios encontrados nos olhos dos animais são acessíveis e os seus circuitos muitas vezes é menos complexa do que no cérebro, fazendo com que estas células bons candidatos para estudo electrofisiológico. As aplicações comuns de eletrofisiologia no olho incluem eletrorretinografia (ERG) 1,2 e microeletrodos de gravação intracelular. ERG envolve a colocação de um eléctrodo dentro ou sobre o olho de um animal, aplicando-se um estímulo de luz e medindo a variação de tensão como a soma de todas as respostas de células vizinhas 3-6. Se alguém está interessado especificamente na caracterização sensibilidades espectrais de células fotorreceptoras individuais, muitas vezes vários tipos de células respondem simultaneamente em diferentes pontos fortes para um dado estímulo; assimpode ser difícil determinar a sensibilidade de tipos específicos de células a partir de dados do ERG especialmente se houver vários tipos diferentes de células fotorreceptoras espectralmente semelhantes no olho. Uma possível solução é criar transgênicos Drosophila com o gene fotorreceptor (opsina) de interesse expressa nas células maioria R1-6 no olho e depois executar ERGs 7. Desvantagens potenciais deste método incluem não a baixa expressão da proteína fotorreceptor 8, eo período de tempo longo para a geração e triagem de animais transgênicos. Para os olhos, com menor número de tipos de fotorreceptores espectralmente distintos, a adaptação do olho com filtros coloridos podem ajudar com a redução da contribuição de alguns tipos de células para o ERG, permitindo assim a estimativa da sensibilidade espectral máximos 9.

gravação intracelular é uma outra técnica em que uma multa eletrodo espeta uma célula e um estímulo é aplicado. Os registros de eletrodos só isso indivA resposta de células idual para que a gravar e analisar várias células individuais podem produzir sensibilidades específicas de fisiologicamente diferentes tipos de células 10-14. Embora o nosso protocolo centra-se na análise de sensibilidade espectral, os princípios básicos da intracelular de gravação com eletrodos pontiagudos são modificáveis ​​para outras aplicações. Usando uma preparação diferente de uma amostra, por exemplo, e usando eléctrodos de quartzo afiadas, um pode gravar a partir de mais profundo no lobo óptica ou outras regiões do cérebro, de acordo com a questão que se coloca. Por exemplo, os tempos de resposta de células fotorreceptoras individuais 15, a actividade de células na óptica lóbulos 16 (lâmina, medula ou lobula 17), cérebro 18 ou outros gânglios 19 também podem ser gravadas com técnicas semelhantes, ou estímulos de cor pode ser substituído com polarização 20 -22 ou movimento estímulos 23,24.

Fototransdução, o processo pelo qual a luzenergia é absorvida e transformada em um sinal eletroquímico, é uma característica antiga comum a quase todos os dias atuais filos animais 25. O pigmento visual encontrado em células fotorreceptoras e responsável por iniciar fototransdução visual é rodopsina. Rodopsinas em todos os animais são constituídos por uma proteína opsina, um membro da família G transmembranar sete do receptor acoplado à proteína, e um cromóforo associado que é derivada de uma molécula de retina ou semelhantes 26,27. Opsina sequência de aminoácidos e estrutura cromóforo afectar a absorvência da rodopsina para diferentes comprimentos de onda de luz. Quando um fotão é absorvido pelo cromóforo a rodopsina torna-se activa, iniciando uma cascata de proteína G na célula que, em última análise conduz à abertura de canais iónicos ligados à membrana 28. Diferentemente da maioria dos neurônios, células fotorreceptoras sofrer alterações potenciais graduados que podem ser medidos como uma mudança relativa na amplitude da resposta com a mudança de estímulo luminoso. Tipicamente, uma dadaTipo de fotorreceptores expressa apenas um gene da opsina (embora existam exceções 8,10,29-31). visão de cores sofisticada, do tipo encontrado em muitos vertebrados e artrópodes, é conseguido com um olho complexo de centenas ou milhares de células fotorreceptoras cada expressando mais uma ou ocasionalmente tipos rodopsina. A informação visual é capturado por comparação das respostas sobre o mosaico de fotorreceptores via de sinalização a jusante neural complexo no olho e no cérebro, resultando na percepção de uma imagem completa a cores e com movimento.

Depois de medir as respostas de matérias de uma das células fotorreceptoras para diferentes comprimentos de onda da luz de gravação via intracelular, é possível calcular a sensibilidade espectral. Este cálculo baseia-se no princípio de Univariance, o que indica que a resposta de uma célula de fotorreceptores é dependente do número de fotões que absorve, mas não sobre as propriedades particulares dos fotões que absorve 32. Qualquer fotões que é absorbed por rodopsina irão induzir o mesmo tipo de resposta. Na prática, isto significa que a amplitude de resposta em bruto de uma célula irá aumentar devido a um aumento na intensidade da luz (mais fotões de absorver), ou a uma mudança no comprimento de onda para a sua sensibilidade de pico (maior probabilidade de rodopsina absorvendo esse comprimento de onda). Nós fazemos uso deste princípio em relacionar as respostas celulares a uma intensidade conhecida e ao mesmo comprimento de onda de respostas em diferentes comprimentos de onda e na mesma intensidade, mas sensibilidade relativa desconhecida. Os tipos de células são frequentemente identificado pelo comprimento de onda a que os seus picos de sensibilidade.

Aqui nós mostramos um método para gravação e análise de sensibilidade espectral de fotorreceptores no olho de uma borboleta intracelular, com um foco em tornar este método mais acessível à comunidade científica em geral. Embora a gravação intracelular continua a ser comum na literatura, particularmente com respeito à visão de cores em insetos, encontramos that descrições de materiais e métodos são geralmente demasiado curto para permitir a reprodução da técnica. Nós apresentamos este método em formato de vídeo com o objectivo de permitir sua replicação mais fácil. Descrevemos também a técnica de utilização de equipamento de fácil obtenção e acessível. Abordamos ressalvas comuns que muitas vezes não são relatados, que retardam a investigação ao otimizar uma técnica nova e complexa.

Protocol

Todos os animais foram tratados o mais humanamente possível. Os insetos foram enviados como pupas de Costa Rica Entomological Supply, Costa Rica. 1. Heliconius Pupae Cuidados Pendure todos pupas espaçadas 2-3 cm de distância em câmara úmida usando os pinos de insetos. Após a eclosão, permitir asas para secar em seguida, manter borboletas vivo por pelo menos 1 dia em câmara úmida e alimentar uma solução diluída de mel por dia antes da gravação. Diluir o mel com…

Representative Results

Para muitos elementos da configuração de gravação, uma descrição escrita não fornece detalhes suficientes. A Figura 1 é um esquema dos componentes envolvidos na configuração completa de gravação. Na Figura 2, os espectros são traçados para a luz branca e cada um filtro de interferência para dar um sentido de por que é necessário um factor de correcção eo que é necessário para calcular essa correção. A Figura 3 mostra fotos e um diagrama d…

Discussion

gravação intracelular pode ser uma técnica difícil de dominar, devido aos muitos passos técnicos envolvidos. Para experiências com sucesso vários pontos importantes devem ser considerados. Em primeiro lugar, é importante ter uma tabela adequadamente vibratoriamente-isolado no qual é realizada a experiência. Muitos pesquisadores usam tabelas de ar, que separam completamente a mesa a partir da base, dando isolamento de vibração superior. Nossa configuração envolve uma mesa de mármore de espessura com uma ca…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Agradecemos ao final de Rudy Limburg para fabricar as perímetro de braço cardan, Kimberly Jamison, Matthew McHenry, e Raju Metherate para nos emprestar equipamentos e Almut Kelber e Kentaro Arikawa, para o incentivo. Este trabalho foi apoiado por uma National Science Foundation (NSF) Graduate Research Fellowship para KJM e concessão NSF IOS-1257627 para ADB

Materials

Butterfly pupae Several local species available, need USDA permits for shipping. Carolina Bio Supply has several insect species that may be ordered within the U.S. without the need for additional permits
Large plastic cylinder Any chamber that remains humidified will work
Insect pins, size 2 BioQuip 1208B2
100% Desert Mesquite Honey Trader Joe's Any honey or sucrose solution will work
Xenon Arc Lamp Oriel Instruments 66003 Oriel is now a part of Newport Corporation
Universal Power Supply Oriel Instruments 68805 Oriel is now a part of Newport Corporation
Optical Track Oriel Instruments 11190 Oriel is now a part of Newport Corporation
Rail Carrier, Large (2x) Oriel Instruments 11641 Oriel is now a part of Newport Corporation
Rail Carrier, Small (4x) Oriel Instruments 11647 Oriel is now a part of Newport Corporation
Thread Adaptor, 8-32 Male to 1/4-20 Male, pack of 10 Newport Corporation TA-8Q20-10
Optical Mounting Post, 1.0 in., 0.5 in. Dia. Stainless, 8-32 & 1/4-20 (5x) Newport Corporation SP-1
No Slip Optical Post Holder, 2 in., 0.5 in. Diameter Posts, 1/4-20 (5x) Newport Corporation VPH-2
Fixed lens mount, 50.8 mm Newport Corporation LH-2
Fixed lens mount, 25.4 mm Newport Corporation LH-1
Condenser lens assembly Newport Corporation 60006
Convex silica lens, 50.8 mm Newport Corporation SPX055
Six Position Filter Wheel, x2 Newport Corporation FW1X6
Filter Wheel Mount Hub Newport Corporation FWM
Concave silica lens, 25.4 mm Newport Corporation SPC034
Collimator holder Newport Corporation 77612
Collimating beam probe Newport Corporation 77644
Ferrule Converter, SMA Termination to 11 mm Standard Ferrule Newport Corporation 77670 This adapter allows the fiber optic to fit into the collimator holder 
600 μm diameter UV-vis fiber obtic cable Oriel Instruments 78367 Oriel is now a part of Newport Corporation
Shutter with drive unit Uniblitz 100-2B
UV Fused Silica Metallic ND Filter, 0.1 OD Newport FRQ-ND01
UV Fused Silica Metallic ND Filter, 0.3 OD Newport FRQ-ND03
UV Fused Silica Metallic ND Filter, 0.5 OD Newport FRQ-ND05
UV Fused Silica Metallic ND Filter, 1.0 OD Newport FRQ-ND10
UV Fused Silica Metallic ND Filter, 2.0 OD Newport FRQ-ND30
UV Fused Silica Metallic ND Filter, 3.0 OD Newport FRQ-ND50
LS-1-Cal lamp Ocean Optics LS-1-Cal
Spectrometer Ocean Optics USB-2000
SpectraSuite Software Ocean Optics
Interference bandpass filter, 300 nm  Edmund Optics 67749
Interference bandpass filter, 310 nm  Edmund Optics 67752
Interference bandpass filter, 320 nm  Edmund Optics 67754
Interference bandpass filter, 330 nm  Edmund Optics 67756
Interference bandpass filter, 340 nm  Edmund Optics 65614
Interference bandpass filter, 350 nm  Edmund Optics 67757
Interference bandpass filter, 360 nm  Edmund Optics 67760
Interference bandpass filter, 370 nm  Edmund Optics 67761
Interference bandpass filter, 380 nm  Edmund Optics 67762
Interference bandpass filter, 390 nm  Edmund Optics 67763
Interference bandpass filter, 400 nm  Edmund Optics 65732
Interference bandpass filter, 410 nm  Edmund Optics 65619
Interference bandpass filter, 420 nm  Edmund Optics 65621
Interference bandpass filter, 430 nm  Edmund Optics 65622
Interference bandpass filter, 440 nm  Edmund Optics 67764
Interference bandpass filter, 450 nm  Edmund Optics 65625
Interference bandpass filter, 460 nm  Edmund Optics 67765
Interference bandpass filter, 470 nm  Edmund Optics 65629
Interference bandpass filter, 480 nm  Edmund Optics 65630
Interference bandpass filter, 492 nm  Edmund Optics 65633
Interference bandpass filter, 500 nm  Edmund Optics 65634
Interference bandpass filter, 510 nm  Edmund Optics 65637
Interference bandpass filter, 520 nm  Edmund Optics 65639
Interference bandpass filter, 532 nm  Edmund Optics 65640
Interference bandpass filter, 540 nm  Edmund Optics 65642
Interference bandpass filter, 550 nm  Edmund Optics 65644
Interference bandpass filter, 560 nm  Edmund Optics 67766
Interference bandpass filter, 570 nm  Edmund Optics 67767
Interference bandpass filter, 580 nm  Edmund Optics 65646
Interference bandpass filter, 589 nm  Edmund Optics 65647
Interference bandpass filter, 600 nm  Edmund Optics 65648
Interference bandpass filter, 610 nm  Edmund Optics 65649
Interference bandpass filter, 620 nm  Edmund Optics 65650
Interference bandpass filter, 632 nm  Edmund Optics 65651
Interference bandpass filter, 640 nm  Edmund Optics 65653
Interference bandpass filter, 650 nm  Edmund Optics 65655
Interference bandpass filter, 660 nm  Edmund Optics 67769
Interference bandpass filter, 671 nm  Edmund Optics 65657
Interference bandpass filter, 680 nm  Edmund Optics 67770
Interference bandpass filter, 690 nm  Edmund Optics 65659
Interference bandpass filter, 700 nm  Edmund Optics 67771
Faraday cage Any metal structure will work that can be grounded and that fits the experimental setup.
Stereomicroscope, 6x, 12x, 25x, 50x magnification Wild Heerbrugg Wild M5 Any Stereomicroscope will do
Microscope stand with swinging arm and heavy base McBain Instruments Any heavy base with arm will do
Cardan arm Custom built, See Figure 4
Fiber-lite high intensity illuminator Dolan-Jenner MI-150 For lighting specimen
Fiber-lite goose-neck light guide Dolan-Jenner EEG 2823 Any goose-neck light guide will do
Marble table
Raised wooden table Hole should be cut through this table so that the sandbox can rest on the marble table underneath
Wooden box filled with sand custom built, any box with sand
Manipulator Carl Zeiss – Jena
Electrode holder
Specimen stage
Alligator clip wires for grounding
Insulated copper wire
Silver wire, 0.125 mm diameter World Precision Instruments AGW0510
BNC cables
Preamplifier with headstage Dagan Corporation IX2-700
Humbug Noise reducer Quest Scientific Humbug
Oscilloscope, 30MHz, 2CH, Dual Trace, Alt-triggering, without probe EZ Digital os-5030
BNC T-adapter
Powerlab hardware 2/20 ADI instruments ML820
Labchart software ADI instruments Chart 5
10 MHz Pulse Generator BK Precision 4030
Glass pipette puller Sutter Instruments P-87
Borosillicate glass capillaries with filament World Precision Instruments 1B120F-4
Potassium chloride, 3 M
Slotted plastic tube
Low melting temperature wax
Soldering Iron Weller
Platform with ball-and-socket magnetic base Hama photo and video
Double edge carbon steel, breakable razor blade Electron Microscopy Sciences 72004
Vaseline
Microsoft Excel Microsoft
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References

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McCulloch, K. J., Osorio, D., Briscoe, A. D. Determination of Photoreceptor Cell Spectral Sensitivity in an Insect Model from In Vivo Intracellular Recordings. J. Vis. Exp. (108), e53829, doi:10.3791/53829 (2016).
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