Abstract
Influenza A virus (IAV) hæmagglutininer genkende sialinsyrer på celleoverfladen som funktionelle receptorer at få adgang til cellerne. Wild vandfugle er den naturlige reservoir for IAV, men IAV kan krydse arter barriere for fjerkræ, svin, heste og mennesker. Fuglevira genkende sialinsyre bundet til en næstsidste galactose ved en α2-3 binding (aviær receptorer) henviser humane vira genkender fortrinsvis sialinsyre med en α2-6 linkage (human-receptorer). For at overvåge, om aviær virus tilpasning til humane receptorer, kan flere metoder anvendes. Glycan mikroarrays med forskellige biblioteker af syntetiske sialosides anvendes i stigende grad til at vurdere receptor specificitet. Imidlertid er denne teknik ikke anvendes til måling aviditeter. Måling af aviditet opnås typisk ved at evaluere bindingen af seriefortyndet hæmagglutinin eller virus til glykaner adsorberet til konventionelle polypropylen 96-brønds plader. I dette assay glycaner med α2-3 eller α2-6 sialinsyrer er koblet til biotin og adsorberet til streptavidin plader, eller er koblet til polyacrylamid (PAA), som direkte adsorbere til plasten. Vi har betydeligt miniature denne analyse ved direkte udskrivning PAA-forbundne sialosides og deres ikke PAA-forbundne modparter på mikro-godt objektglas. Dette set-up, med 48 arrays på en enkelt dias, muliggør samtidige analyser af 6 glycan proteiner på 8 fortyndinger, spørgekriterierne 6 forskellige glykaner, herunder to ikke-sialylerede kontroller. Det svarer til 18x plader med 96 brønde i den traditionelle plade-assay. Den glycan arrayformat nedsætter forbruget af forbindelser og biologiske og således i høj grad forbedrer effektiviteten.
Introduction
Wild vandfugle er den naturlige reservoir for IAV, men IAV er i stand til at krydse artsbarrieren til fjerkræ og pattedyr, herunder, mennesker. Avian IAVs genkender α2-3 forbundne sialinsyrer (aviær type receptorer), hvorimod human virus binder α2-6 forbundne sialinsyrer (menneske-type receptorer). At være i stand til effektivt at replikere og overføre mellem mennesker en aviær IAV behov for at binde til human-receptorer 1.
IAVs er opdelt baseret på serologi som kendetegner antigeniciteten af deres hemagglutinin (HA) og neuraminidase (NA) kappeglycoproteiner. HA binder til sialinsyrer, hvorimod NA er den receptor-ødelæggende enzym i den anden ende af det virale livscyklus og spalter sialsyre 2. Alle menneskelige inficerende virus, herunder H1N1, H2N2 og H3N2, har en aviær oprindelse 3. I løbet af de to sidste årtier flere aviær menneskelige delefiltre har fundet sted, med H5N1, H7N7, og H7N9 er den mest kendte; however, har andre undertyper inficerede mennesker mere sporadisk (H6N1, H7N1, H7N2, H9N2, H10N7, H10N8) 4. Heldigvis ser det ud til, at ingen af disse vira har været i stand til fuldt ud at tilpasse sig til human type α2-6-linked sialinsyrereceptorer 5-8. Tilpasning af aviær eller andre zoonotiske vira til at rumme replikation og transmission i menneskelige værter kunne have en ødelæggende virkning på menneskers sundhed. Derfor forudgående viden om, hvordan disse vira udvikler sig til at binde human receptorer vil hjælpe verdensomspændende overvågning af nye influenzavira.
Bestemmelse af receptor præference blev først belyst ved hjælp af erythrocytter af forskellige arter og er stadig et yndet assay blandt influenza forskere 9-12. Påvisningen af, at aviære vira genkende α2-3 sialinsyre og menneskelige vira α2-6 knyttet sialinsyre blev oprindeligt baseret på et assay ved anvendelse hæmagglutinering af erytrocytter enzymatisk manipuleret til at indeholde hver af de linkages 13,14. Selvom udlæsning er hæmagglutinering, et standardassay for virologer, er de underliggende glykanstrukturer ikke defineret, kun det terminale binding. Derudover den begrænsede tilgængelighed af de sialyltransferaser, der anvendes til at re-sialylere cellerne, har begrænset anvendelsen af dette assay 15-18. Efterfølgende blev andre metoder til bestemmelse receptorbindende præferencer indføres ved anvendelse af sialylerede glykanstrukturer knyttet til poly-acrylamid (PAA) eller poly-glutamat (PGA) strukturer i plade-assays 19,20. Adskillige variationer er mulige i overtrækning enten glykaner eller vira til mikrotiterplader, der hver især resulterer i en robust, pålidelig og meget følsom ELISA-assay 21-23. Alternativt kan biotin-forbundne glycaner erstatte PAA / PGA og kan konjugeres til streptavidin-coatede plader 2,24. Selv om der kan kræves nogle specifikke sera, ELISA er standard og flere glykaner knyttet til PAA let commercially og ikke-kommercielt tilgængelige (Consortium for Funktionelle Glycomics (http://www.functionalglycomics.org)).
Glycan microarray teknologi er dukket op som et uvurderligt værktøj til at bestemme receptor specificitet, som flere forskellige glykaner er plettet, og binding til en bred vifte af forskellige strukturer kan vurderes inden for en enkelt assay 25-29. Den binding af IAV til disse strukturer giver en bedre forståelse af de glykanstrukturer der IAV fortrinsvis genkender 30-33. Glycan mikroarrays kræver små mængder af prøvevolumen til at udføre et bindingsassay og bruger kun små mængder af glycan pr plet (2 nl). Men disse arrays typisk brugt til at evaluere specificiteten af glycaner receptorer. Analyse af flere vira eller hæmagglutinin proteiner, ved multiple koncentrationsområder kan være uoverkommelige på grund af antallet af objektglas, der kræves. Endvidere til dato ingen relativ aviditet assay er blevet udviklet ved hjælp af glycan array teknikker.
For at kombinere det lave prøve gives ved glycan microarray teknikker og følsomheden af PAA-forbundne glycaner i ELISA-baserede assays, vi søgt at udvikle en multi-brønd glycan array, der ville give mulighed for high-throughput analyse med tilsvarende eller bedre opløsning sammenlignet til den traditionelle ELISA-baseret assay. Samtidig ønskede vi at minimere mængden af biologiske og reporter kemikalier forbruges. Det endelige resultat er en miniaturiseret aviditet assay specielt udviklet til overvågning IAV specificitet og er lige så anvendelig til at vurdere andre glycan bindende proteiner. Brug af et objektglas adskilt i 48 mikro- brøndene ved en Teflon maske, er 6 forskellige glycaner spottet i 6 replikater pr brønd. Microarray platform frembyder de samme tendenser i receptorbinding ses i makro ELISA-format med flere fordele. Disse omfatter (I) trykning af forbindelse i 6 replikater, under anvendelse minimal prøve, versus overfladebehandling af flere rækker ina plade, ved hjælp af 100 pi per brønd; (II) flere forskellige forbindelser analyseres samtidigt i en enkelt brønd, herunder kontrol; (III) en massiv nedgang i inkubation volumen og; (IV) et større dynamikområde under anvendelse af en fluorescerende udlæsning. En enkelt dias kan beregnes at svare til 18x 96-brønds plader.
Med følgende protokol, enhver lab stand til fremstilling og analyse plettet mikroarrays bør kunne fremstille denne miniaturiseret ELISA-format.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
BEMÆRK: gennemføres Alle trin ud ved stuetemperatur, medmindre andet er angivet.
1. Array Byggeri
- Glycan Forberedelse og Plate Setup
- Forbered et lager af trykning buffer. Først skal 500 ml af en 150 mM stamopløsning af dinatriumphosphat. Også gøre 50 ml af en 150 mM stamopløsning af natriumdihydrogenphosphat-opløsning. I en kolbe under anvendelse af en magnetisk omrører og pH-meter, langsomt titrere dibasisk natriumphosphatopløsning med monobasiske opløsning indtil en pH på 8,5 er nået. Tilføj Tween-20 til 0,005%.
- Forbered glycan prøver. Fortynd PAA konjugerede glykaner, (diLacNAc (Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAcβ-PAA), 3SLNLN (Neu5Acα2-3Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAcβ-PAA) og 6SLNLN (Neu5Acα2-6Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAcβ-PAA (figur 1A )) skal fortyndes til 100 pg / ml i udskrivning buffer fra step1.1.1. Monovalente glykaner,diLacNAc (Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAcβ- (CH2) 3 NH2, 3SLNLN (Neu5Acα2-3Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAcβ - (CH2) 3 NH2) og 6SLNLN (Neu5Acα2-6Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1- 4GlcNAcβ - (CH2) 3 NH2)) til 100 uM i udskrivning buffer fra trin 1.1.1. Endelig, forberede amin-funktionaliserede farvestoffer, til at bruge som gitter markører / landingslys. Farvestofmarkør pletter er trykt på 1 uM.
BEMÆRK: Atto488-NHS farvestof anvendes i vores udskrifter. Men enhver amin-funktionaliserede farvestof, læses af dias scanner er egnet til dette formål. - Transfer 10 pi af hver glycan prøve til 384-brønds mikrotiterplader, som anvendes til trykning robot. Opbevar ubrugte glycaner i trykning pufferopløsning ved -20 ° C i forseglede rør. Tansfer 10 pi af farvestoffet markør til trykpladen.
- Trykning
BEMÆRK: Alle steps der vedrører røre eller flytte dias skal gøres med handsker.- Placer arrayer stifter i trykning hoved i henhold til den korrekte konfiguration af layoutet. Til dette layout bruge en pin til at udskrive alle prøver og arrays. Udskriv glycaner i blokke af seks, springer et træk (en funktion er defineret som enkelt plet af en bestemt forbindelse), på hver side, således at pletter af samme prøve ikke er trykt nøjagtigt ved siden af hinanden.
BEMÆRK: Slutbrugeren skal afgøre konfigurationen. - Fjern slides fra poser, åbne kasser, og fjern eventuelle støvpartikler eller små stykker af plast, der kan være på deres overflader ved at blæse ultra-høj renhed Nitrogen gas på hvert dias. Placer det ønskede antal dias, belagt opad, på arrayer scenen.
- Programmér arrayer bruge parametrene for 27 pletter per besøg til kilden plade, hjælp 3 "pre-spots" på poly-L-lysin coatede dias, for at fjerne overskydende væske på spidsen af trykning stifter
- Tænd MPU (Main Power Unit) og Climate Control Unit. Åbent Fliselægning Analysis software på computeren.
- Vælg layout til print. Vælg Valg → Pin Tool til at blive brugt til udskrivning arrayet 1 x 1 print værktøj - en enkelt pin. Vælg fanen Target → Tool Array Definition → Print Pattern og tilsæt banen (spot-til-spot afstand), at antallet af rækker og kolonner til at rumme prøverne skal udskrives, og trykning mønster af prøverne (for dette array en 8 x 8 udskrivning mønster bruges ved 340 um plads til 7 af total prøver).
- Vælg Target → Slide Layout og programmere blok-til-blok afstand for at tillade udskrivning af hver gentagelse array i 48-brønd (4 x 12) slide skabelon. Vælg Kilde og tilsæt antal kildekode pickups (1 for hver prøve ved anvendelse af 1 ben) (for denne print 7 source pickupper vil blive anvendt til at rumme 6 prøvebrønde og 1 farvestofmarkør godt).
BEMÆRK: Kilden dialog bør blive grøn for at vise, at antalletaf kilde besøg matcher prøver, der skal udskrives i den trykte mønster. - Vælg Target → Adapter Plate og Slide Layout og justere dias nummer (5 slides udskrives på et tidspunkt for dette print med en pre-spotting slide).
- Slip bakken ved at klikke på knappen T1 for at aktivere bakken og tilføje det ønskede antal lysbilleder til bakken, meget opmærksom på placeringen af præ-spotting slide (blå) og "rigtige" dias.
- Placer plain objektglas på alle resterende vakuumporte at blokere vakuum og klik på OK for at aktivere vakuum. Kontroller, at alle dias holdes på plads, og klik på OK for at vende tilbage bakken til udgangspositionen.
- Læg trykpladen i holderen pladen og sikre stativet er indstillet korrekt på plads. Klik GO og tillade trykprocessen at fortsætte.
- Udskrive de resterende 24 pletter i replikater af 6 spots pr Array (4 arrays / kilde besøg).
- Indlæse 384-brønds pladeri printeren og starte udskrivningen. Vedligehold relativ luftfugtighed, mens der udskrives, hele print mellem 55 og 65%. Printeren stopper efter udskrivning 5 dias.
BEMÆRK: Mens mikroarrayet i dette assay er trykt i et specifikt 8 x 8 mønster, vil forskellige microarray trykning robotter kræver udstyr specifik programmering for at opnå den ønskede layout. Det er op til den endelige bruger til at bestemme den mest hensigtsmæssige mønster givet deres udstyr specifikationer.
- Placer arrayer stifter i trykning hoved i henhold til den korrekte konfiguration af layoutet. Til dette layout bruge en pin til at udskrive alle prøver og arrays. Udskriv glycaner i blokke af seks, springer et træk (en funktion er defineret som enkelt plet af en bestemt forbindelse), på hver side, således at pletter af samme prøve ikke er trykt nøjagtigt ved siden af hinanden.
- Befugtning / immobilisere
BEMÆRK: Når slides er færdig med at udskrive, gennemgår de en midlertidig immobilisering skridt, også kaldet befugtning. Befugtning post-print er med til at homogenisere prøven vedhæftet fil ved at re-fugte pletterne og sikre fuldstændig blokering.- Sætte glider i en 100% luftfugtighed kammer lige efter udskrivning i en periode på 30 min. Konstruere kammeret ved at placere meget våd papirservietter flade i bunden af en stor glasskål, placere objektglassenepå en slags rack, såsom et reagensglas rack, udskriftssiden opad, og forsegling med plastfolie at fange i fugt.
- Antal glider med en alkohol / opløsningsmiddel resistente mærkning pen og opbevares i en udtørring kassen. Tørre ud natten over.
- Nummerering, Blokering og opbevaring
- Forbered blokerende buffer - 50 mM ethanolamin i 50 mM borat-buffer. Først opløses borsyre, i Hedeselskabet 2 O, til en slutkoncentration på 50 mM i en kolbe indeholdende en magnetisk omrører. Opløsningen omrøres kraftigt på en omrøring plade, indtil alt fast stof er opløst. Mens konstant omrøring, tilsæt passende mængde af ethanolamin fra en 16,54 M stamopløsning for at nå den ønskede 50 mM koncentration. Tilføj koncentreret natriumhydroxid til justering til en endelig pH på 9,2.
- Fordybe de trykte objektglas i blokerende buffer opløsningen i 1 time.
- Efter 1 time, skylles dias i Hedeselskabet 2 O for at fjerne eventuelle overskydende spor af blokerende buffer.Bortskaf blokerende buffer i en egnet affaldsbeholder.
- Overfør dias til glas farvning indehavere og spin tør. Tørre arrays ved at placere dem i en centrifuge udstyret med svingende plade holdere, ved en hastighed på 10 x g i 5 min.
- Når objektglassene er tørre, kan de inkuberes straks eller opbevares. Opbevaringsbetingelser er -20 ° C i en forseglet plastpose.
2. Analyse glycan-bindende proteiner
- Forbered et befugtet kammer, hvor arrays skal hybridiseres vil passe. En simpel kammer består af en Pyrex fad, lagdelt på bunden med dæmpede papirhåndklæder og et rack, hvorpå dias vil hvile.
- Brug biotinylerede lectiner SNA (Sambuca nigra agglutinin) og ECA (Erythrina cristagalli agglutinin) ved 10 ug / ml + 2 ug / ml streptavidin-555-farvestof, i probing buffer (PBS + 0,01% Tween-20). For HA (A / Vietnam / 1203-1204 H5N1 og A / KY / 07 H1N1, i dette eksempel), brugen start koncentration på 20 ug / ml pre-kompleksbundet, som tidligere beskrevet 34. Kort fortalt, lave en HA: Mouse-α-Strep: Goat-α-Mouse-Alexa647 blandingen i blokerende buffer (PBS + 3% BSA + 0,01% Tween-20) ved et 4: 2: 1 molforhold.
BEMÆRK: array er probes med lektiner at konstatere, at glykaner er immobiliserede og påviselig (figur 1B). - Overfør glycan bindingsprotein-antistof mix opløsning af 20 pi til en plade med 384 brønde og inkuber på is i 30 minutter. Serielt fortyndet lectin og HA prøverne 1: 1, i deres passende puffer, 8 gange, ved at blande 10 pi af prøven med 10 pi buffer.
- Pipette 8 pi af prøven på mikro-brøndens overflade og inkuberes i den forseglede befugtning (100% RH) kammer i 90 min.
- Vaskes objektglassene en ad gangen ved at holde kanterne og dypning dem fire gange i en blanding af PBS og 0,05% Tween, derefter fire gange i PBS, og endelig fire gange i deioniseret H2O Ved brug afden samme tørring beskrevet i det blokerende trin-protokollen, dreje arrays tørre i en centrifuge i 5 minutter ved 10 x g.
3. Scanning og Data Analyser
BEMÆRK: De glycan microarrays kan scannes ved forskellige indstillinger, afhængigt af microarray scannerens producenten. Ved at variere lasereffekt og opløsning, kan instrumentet frembringe et billede med så mange signaler som muligt inden for dens dynamikområde (figur 1C).
- Brug en fluorescerende slide scanner og scanne arrays umiddelbart efter inkubering med de glycan bindingsproteiner. Vær omhyggelig med at sikre, at slæden er korrekt indsat i scanningen instrument.
- Åbn scanning software. Klik på Start for at åbne programmet. Tilslut til scanner: Scanner → Connect eller grønne knap i menuen i panelet Scanner navigation.
- Åbent autoloader dør af scanneren. Placer dias i slots i autoloader i bestemt rækkefølge. Luk autoloader dør. Click "læse loader" i Tools navigationspanelet registreres automatisk dias i scanneren.
- Indstil scanning parameter: Scanner → Scan parametre passende til eksperimentet (fx 635 laser magt høj, afsløring gain 50%). Scan dias: Scanner → scanningsindstillinger. Vælg stien ved at oprette en mappe til at gemme de scannede billeder og navn individuelle scanninger. Gør dette før den egentlige scanning. Gentag for hver enkelt dias. Klik på OK for at starte scanningen.
- Brug scannerens software til at oprette instrumentet og scanne dias. Indstil scanner til iterativt scanne ved lav lasereffekt (5 mW) med stigende gain-indstillinger på 25%, 50% og 75%.
BEMÆRK: Indstillingerne kan testes og optimeres, men husk på, at hver scanning muligvis kan sænke fluorescens output af farvestofferne grundet fotoblegning.- Åbn dataindsamling og analyse software som Mapix software. Klik på Start for at åbne programmet. Åbn scan billede: Filer → Åbn imalder. Åbent GAL fil: Analyser → åben gitter og vælg den relevante GAL-fil.
- Indtast blokke mode: Billede → blokerer funktionen til at flytte gitteret. Brug gitter markører for at indstille gitteret til den relevante placering på diaset. Juster enkelte blokke efter behov for at matche den trykte array.
- Indtast spots mode: Billede → spots tilstand for at justere placering og størrelse af de enkelte pletter inden blokken. Når alle blokke og pletter justeres og på plads, måle signalintensiteter ved Analyser → fotometriske beregninger. Gem output fil.
- Når dias er færdig med at scanne, er billeder, analyseres for binding signaler med billedbehandling program installeret (Figur 1D - G). For billedanalyse, indlæse en GAL (Array List) fil over det scannede TIFF-billede.
BEMÆRK: GAL-filen indeholder både stedet layout mønster og identitet hver plet placering. GAL-filer til arrays er crprettet af printersoftwaren ved hjælp af en tabulatorsepareret tekstfil, der indeholder identiteten af de prøver og deres placering i 384-godt kilde plade. - Brug gitter markør / landingslys trykt på microarrays til korrekt placere GAL nettet. Individuelle pletter kan være nødvendigt at blive flyttet enkeltvis, men et godt trykt opstilling vil generelt give blokke i gitteret skal placeres uden problemer. Efter grid placering, indsamle spot intensiteter af softwaren og gemmes som en tabulatorsepareret tekstfil (.txt).
- Ved hjælp af regneark, skal du åbne uddatafilen fra scanneren. Åbn den relevante makro-filen fra den placering mappen. Klik på Vis → Makro → RunMacro.
BEMÆRK: pre-skrevet vil kopiere de rå uddata, fjerne unødvendige rækker og kolonner, sortere data efter prøven, beregne de gennemsnitlige gennemsnitlige signal minus baggrundsværdier og plot de resulterende værdier i en spread-sheet regneark indeholder grafer for hver af de seks Samples testet på arrayet.
- Ved hjælp af regneark, skal du åbne uddatafilen fra scanneren. Åbn den relevante makro-filen fra den placering mappen. Klik på Vis → Makro → RunMacro.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Udskrivning, scanning og data-analyser
For at sikre korrekt udskrivning, er det afgørende at have den korrekte tilpasning af den plettede grid inden for teflon maske, som afgrænser hvert array på diaset. Ved udskrivning, på grund af karakteren af teflon belægning, kan pletter ikke ses af det blotte øje på MPX objektglas. Der lægges vægt derefter til udseendet af de pre-pletter på poly-L-lysin coatede objektglas. Direkte efter udskrivning, skal hvert objektglas kontrolleres visuelt for tilstedeværelsen af hver plettede forbindelse, som er synlig på grund af bufferens salte tørret i stedet. Arrays inspiceres for korrekt tilpasning af pletter inden for Teflon grænser og korrekte antal plettede funktioner.
Slides scannes i en iterativ proces med lavere til højere scan magt at undgå fotoblegning og tillade sammenligning af HIGhendes aviditet til lavere reaktionsvillighed bindende proteiner, som har højere og lavere udgangssignaler henholdsvis. Efter scanning, er den fluorescerende intensitet hver plet i output billeder målt ved hjælp af et billedbehandlingsprogram. Hver opstilling er overlagt med et gitter fil, der svarer til det antal funktioner trykt på arrayet overflade (figur 1 D - G). Brug af trykte fluorescerende farvestoffer, der grænser de trykte glykaner defineret, og en maske, der er integreret med identiteten af den trykte prøve lasso hver plet. Den billeddannende maske lasso vil registrere alle aspekter af det afbildede plet (størrelse, signal intensitet, koordinater i nettet, etc.) og output disse oplysninger til en tabulatorsepareret tekstfil. Brug tabelopstilling software (regneark), er prøverne ordnet efter identitet og den gennemsnitlige signal intensitet minus baggrund er i gennemsnit over 4 af de 6 spots for hver prøve, og udelade den højeste og laveste signal som outliers. En linje graf over gennemsnitlige middelværdi-signalminus baggrund er afbildet mod de otte proteinkoncentrationer anvendt til arrayet og indeholder en linje for hver prøve. Det endelige output graf udglattes under anvendelse af en ikke-lineær regression beregning (fig 1I).
Glycan bindende proteiner
PAA-Array bruges til at vurdere receptorbindende specificitet af influenza A virus hæmagglutininer. Et yderligere element i vores array, ikke er til stede i den analoge plade assay, er inddragelsen af ikke-sialylerede kontroller i samme mikro-godt. For at vurdere, at trykte forbindelser er til stede efter udskrivning, der almindeligvis anvendes plante lektiner med blev brugt kendt specificitet. ECA binder sig til terminal galactose koblet β1-4 til N-acetyl-glucosamin (Galβ1-4GlcNAc eller LacNAc) og vil ikke binde, hvis terminalen galactose er udjævnet med sialsyre. ECA kun registrerer de ikke-sialylerede glykaner på vores miniaturiserede glycan array (figur 2A). Den manglende binding til nogen af de sialylerede glycan prøver tyder også at disse er fuldt afsluttet med terminal sialinsyre. For α2-6 koblet sialinsyre, blev SNA anvendt som et lectin kontrol (figur 2B). Som forventet, SNA kun binder sig til α2-6 forbundet sialinsyrer, men med bemærkelsesværdige forskelle i affinitet for PAA-linked ikke-PAA-koblet di-LacNAc gentagelser. Denne forskel afspejler følsomheden af PAA-forbundne glycaner og tillader diskrimination af proteiner, der kan binde med lav aviditet. For α2-3 koblet sialinsyre, en H5 hæmagglutinin fra A / Vietnam / 1203-1204 virus, der er kendt for at genkende α2-3 knyttet sialic kun syrer blev anvendt 6. Den bindende profil af H5 HA viser faktisk specificitet for α2-3 forbundne sialinsyrer, med en højere aviditet for PAA-bundne strukturer (figur 2C). Endelig blev H1 hæmagglutinin fra et humant sæsonbestemt H1N1-stamme anvendes som forventet, kunbundet til α2-6 forbundet sialinsyre indeholder strukturer (figur 2D).
Figur 1: Udskrivning, scanning og billede analyser (A) PAA-konjugeret 6SLNLN er vist som en repræsentativ glycan struktur, der er trykt på objektglas.. (B) inkubering af en glycan bindingsprotein på multi-brønd glycan array er vist med en 8 pi volumen, der skaber en dråbe på arrayet overflade. (C) Efter inkubering af glycan bindingsproteiner på arrayet og scanning i et konfokalt fluorescerende slide scanner, opnås en repræsentativ billede. (D) Billedet er overlejret med et gitter og ved hjælp af gitter markører for korrekt justering, kan analyseres de enkelte pletter. (E) En tæt op af et komplet sæt af 8 arrays, hvor en enkelt glycan bindende proteinblev analyseret under anvendelse otte 1: 1 fortyndinger. (F) En enkelt array, i en enkelt brønd, er repræsenteret; arrayet demarkerede i skemaet markører i øverste højre (3 steder) og nederste venstre (2 steder), denne glycan bindende protein binder en enkelt forbindelse på arrayet som en gengivelse af seks er klart synlig. (G) Risten er vist med lassoer omkranser specifikke individuelle pletter. (H) Imaging software beregner signalværdier fra billedfilen og udsender et tabulatorsepareret datafil. (I) Dataene kan være angivet på regneark eller stastical software til at skabe et repræsentativt output graf. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Output af plante lektiner (ECA, SNA) og IAV HEMAgglutinins med forskellige specificiteter (H5 fra A / Vietnam / 1203-1204, H1 fra A / Kentucky / 07). (A) ECA binder terminal LacNAc eller Galb1-4GlcNAc specifikt og detekterer tilstedeværelsen af de ikke-sialylerede forbindelser, der anvendes som kontrol for IAV hæmagglutininer. (B) SNA genkender kun glycaner bærer en terminal α2-6 sialinsyre. (C) Det rekombinante hæmagglutinin af H5N1 (A / Vietnam / 1203/04) stamme binder til α2-3 sialinsyrer og tilvejebringer en aviær typen receptorbindingsprofil. (D) Det rekombinante hæmagglutinin af en menneskelig sæsonbestemt H1N1 (A / Kentucky / 07) binder sig til receptorer kun human type. Fluorescerende signal intensitet blev målt for hver plet, og middelintensitet minus betyde baggrund blev beregnet ved anvendelse regnearksprogram. For hver glycan, er den gennemsnitlige signalintensitet beregnet fra 6 replikater pletter. De højeste og laveste signalerne fra 6 gentagelser er fjernet, og de resterende 4 replikates anvendes til at beregne den gennemsnitlige signal, standardafvigelse (SD), og standardfejlen måling (SEM). Graferne repræsenterer gennemsnit gennemsnitlige signal minus baggrund for hver prøve og fejl barer er SEM værdi. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vurdering IAV receptor specificitet er et vigtigt skridt i at analysere pandemisk potentiale aviær virus. Sialinsyre genkendelse af viruset er knyttet til flere biologiske egenskaber, såsom binding til og frigivelse fra cellen. Viden om hvilke amino-syre-mutationer er nødvendige for aviær virus at opnå α2-6 bindende og krydse artsbarrieren muliggør pandemiberedskab. Adskillige assays anvendes til at bestemme receptor specificitet; Men alle har deres ulemper, herunder kun måle aviditet og ikke specificitet og vice versa.
Her beskriver vi en hidtil ukendt miniaturiseret værktøj baseret på den udbredte og anerkendte ELISA, der anvender PAA-bundet terminale fragmenter af mere komplekse glycaner. Brug 4 veldefinerede lektiner, 2 af anlæg og 2 i influenza A-virus oprindelse, viser vi, at vi fastholder specificitet og relativ aviditet.
Når vi beregne mængden af reduktion af kemikalier og biologistical bruges af miniaturizing ELISA på en glycan-chip, nå vi påfaldende store forskelle. Første, biologiske; vi bruger 10x mindre assayvolumen og anvende 6 testforbindelser i 6 replikater, dette kan beregnes til at være svarende til 36x rækker i plader med 96 brønde. Resultatet er, at vi bruger 360X færre biologiske. Kritiske skridt omfatter korrekt udskrivning og risikoen for høje baggrunde anvender urensede glycan bindemidler eller dårlige påvisning af antistoffer.
Forbindelserne anvendt i dette assay, men stadig til rådighed, er ikke let fremstilles ved kemo-enzymatisk syntese. Brug microarray-printteknologi, hver plet er kun 2 nl, sammenlignet med 100 pi per brønd i en mikrotiterplade. Udskrivning af en enkelt dias indeholder 48 brønde og 6 forbindelser, i 6 gentagelser, vi forbruger ca 1152 nl. Den samme coating procedure i 96-brønds plader resulterer i at overtrække i alt 1.842 brønde med 100 pi forbindelse i den samme koncentration. Derfor trykning than sammensatte forhold til pladen assayet, opnår vi en slående reduktion af 1,500x. Derfor, i alt, er biologiske reduceret 360 gange og glycan forbrug af 1.500-fold. Brug af robot væskehåndteringsudstyr, vi forestiller at de fleste trin kan automatiseres, således at hele assayet anvendes som et høj-throughput screen.
Selvom udskrivning microarrays og efterfølgende billede analyser gøre kræver særlige maskiner og værktøj, disse instrumenter er ikke sjældne og er til stede på mange universiteter og institutter. Udskrivning er direkte og kræver ikke kemiske ændringer. Derfor mener vi, at med denne minimale mængde af forbindelser og enkel trykteknik, kunne denne analyse være mere generelt anvendelig. Som det reducerer inkubationen volumen, omkostninger til antistoffer og dyrebare biologiske, vil denne teknik gør det muligt for laboratorier med begrænsede ressourcer til at vurdere specificitet IAV eller andre glycan bindende proteiner med high fidelity, samtidig med at lavere omkostningers.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet delvist af Scripps Microarray Core Facility, og en kontrakt fra Centers for Disease Control (JCP). RPdV er en modtager af en Rubicon og VENI bevilling fra Holland Organisation for Videnskabelig Forskning (NWO). Konsortiet for Funktionelle Glycomics (http://www.functionalglycomics.org/) finansieret af NIGMS tilskud GM62116 (JCP), forudsat flere glycaner anvendt i denne undersøgelse. Dette er publikation 29113 fra The Scripps Research Institute.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NEXTERION® Slide H MPX-48 | Schott | 1091525 | Microwell slides |
| ProScanArray Plus | PerkinElmer | discontinued | confocal microarray scanner |
| Innoscan 1100AL Scanner/Mapix Software | Innopsys | - | confocal microarray scanner |
| MicroGrid II | Digilab | - | microaray printer |
| SNA | Vector Labs | B-1305 | Plant Lectin |
| ECA | Vector Labs | B-1145 | Plant Lectin |
| Anti-Strep Antibody | IBA | 2-1509-001 | Anitbody for HA binding |
| Anti-Mouse Alexa-647 | Life | A-21235 | Anitbody for HA binding |
| Tween-20 | Sigma | P2287 | detergent |
| di-basic Sodium Phosphate | Sigma | 255793 | printing buffer component |
| mono-basic Sodium phosphate | Sigma | 229903 | printing buffer component |
| poly-l-lysine solution | Sigma | P8920 | pre-spotting slide component |
| sodium hydroxide | Sigma | 221465 | pre-spotting slide component |
| ethanol | Sigma | 493546 | pre-spotting slide component |
| phosphate buffered saline | Corning | 46-013-CM | incubation/washing buffer |
| SMP4B pins | Telechem | SMP4B | printing pin |
| Compressed Nitrogen (Grade5) | Praxair | UN1066 | general dusting/drying tool |
| Boric Acid | Sigma | B6768-500G | Slide blocking reagent |
| ethanolamine | Sigma | E9508-500ML | Slide blocking reagent |
| Atto 488 | AttoTec | AD 488-91 | Gridmarker on array |
| PAA-LNLN | Consortium for Functional Glycomics | PA368 | Spotted glycans |
| PAA-3SLNLN | Consortium for Functional Glycomics | PA362 | Spotted glycans |
| PAA-6SLNLN | Consortium for Functional Glycomics | PA343 | Spotted glycans |
| LNLN | Consortium for Functional Glycomics | Te98 | Spotted glycans |
| 3SLNLN | Consortium for Functional Glycomics | Te175 | Spotted glycans |
| 6SLNLN | Consortium for Functional Glycomics | Te176 | Spotted glycans |
| 384-well microtiter plate | Matrix TechCorp | 4361 | Printing plate |
| VWR lab marker | VWR | 52877-150 | Slide Numbering |
| Wheaton slide staining dish | Sigma | Z103969-1EA | Blocking and Drying |
References
- Tumpey, T. M., et al. A two-amino acid change in the hemagglutinin of the 1918 influenza virus abolishes transmission. Science. 315 (5812), 655-659 (2007).
- Xu, R., et al. Functional balance of the hemagglutinin and neuraminidase activities accompanies the emergence of the 2009 H1N1 influenza pandemic. J Virol. 86 (17), 9221-9232 (2012).
- Bouvier, N. M., Palese, P.
- Freidl, G. S., et al. Influenza at the animal-human interface: a review of the literature for virological evidence of human infection with swine or avian influenza viruses other than A(H5N1). Euro Surveill. 19 (18), (2014).
- Xu, R., et al. Preferential recognition of avian-like receptors in human influenza A H7N9 viruses. Science. 342 (6163), 1230-1235 (2013).
- Paulson, J. C., de Vries, R. P. H5N1 receptor specificity as a factor in pandemic risk. Virus Res. 178 (1), 99-113 (2013).
- Tzarum, N., et al. Structure and receptor binding of the hemagglutinin from a human H6N1 influenza virus. Cell Host Microbe. 17 (3), 369-376 (2015).
- Zhang, H., et al. A Human-Infecting H10N8 Influenza Virus Retains a Strong Preference for Avian-type Receptors. Cell Host Microbe. 17 (3), 377-384 (2015).
- Carroll, S. M., Higa, H. H., Paulson, J. C. Different cell-surface receptor determinants of antigenically similar influenza virus hemagglutinins. J Biol Chem. 256 (16), 8357-8363 (1981).
- Gambaryan, A. S., et al. Specification of receptor-binding phenotypes of influenza virus isolates from different hosts using synthetic sialylglycopolymers: non-egg-adapted human H1 and H3 influenza A and influenza B viruses share a common high binding affinity for 6'-sialyl(N-acetyllactosamine). Virology. 232 (2), 345-350 (1997).
- Rogers, G. N., D'Souza, B. L. Receptor binding properties of human and animal H1 influenza virus isolates. Virology. 173 (1), 317-322 (1989).
- Rogers, G. N., et al. Single amino acid substitutions in influenza haemagglutinin change receptor binding specificity. Nature. 304 (5921), 76-78 (1983).
- Paulson, J. C., Rogers, G. N. Resialylated erythrocytes for assessment of the specificity of sialyloligosaccharide binding proteins. Methods Enzymol. 138, 162-168 (1987).
- Paulson, J. C., Sadler, J. E., Hill, R. L. Restoration of specific myxovirus receptors to asialoerythrocytes by incorporation of sialic acid with pure sialyltransferases. J Biol Chem. 254 (6), 2120-2124 (1979).
- Chutinimitkul, S., et al. In vitro assessment of attachment pattern and replication efficiency of H5N1 influenza A viruses with altered receptor specificity. J Virol. 84 (13), 6825-6833 (2010).
- Glaser, L., et al. A single amino acid substitution in 1918 influenza virus hemagglutinin changes receptor binding specificity. J Virol. 79 (17), 11533-11536 (2005).
- Herfst, S., et al. Airborne transmission of influenza A/H5N1 virus between ferrets. Science. 336 (6088), 1534-1541 (2012).
- Nobusawa, E., Ishihara, H., Morishita, T., Sato, K., Nakajima, K. Change in receptor-binding specificity of recent human influenza A viruses (H3N2): a single amino acid change in hemagglutinin altered its recognition of sialyloligosaccharides. Virology. 278 (2), 587-596 (2000).
- Gambaryan, A. S., Matrosovich, M. N. A solid-phase enzyme-linked assay for influenza virus receptor-binding activity. J Virol Methods. 39 (1-2), 111-123 (1992).
- Totani, K., et al. Chemoenzymatic synthesis and application of glycopolymers containing multivalent sialyloligosaccharides with a poly(L-glutamic acid) backbone for inhibition of infection by influenza viruses. Glycobiology. 13 (5), 315-326 (2003).
- Gambaryan, A., et al. Receptor specificity of influenza viruses from birds and mammals: new data on involvement of the inner fragments of the carbohydrate chain. Virology. 334 (2), 276-283 (2005).
- Ito, T., et al. Receptor specificity of influenza A viruses correlates with the agglutination of erythrocytes from different animal species. Virology. 227 (2), 493-499 (1997).
- Watanabe, Y., et al. Acquisition of human-type receptor binding specificity by new H5N1 influenza virus sublineages during their emergence in birds in Egypt. PLoS Pathog. 7 (5), e1002068 (2011).
- Chandrasekaran, A., et al. Glycan topology determines human adaptation of avian H5N1 virus hemagglutinin. Nat Biotechnol. 26 (1), 107-113 (2008).
- Blixt, O., et al. Printed covalent glycan array for ligand profiling of diverse glycan binding proteins. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (49), 17033-17038 (2004).
- Childs, R. A., et al. Receptor-binding specificity of pandemic influenza A (H1N1) 2009 virus determined by carbohydrate microarray. Nat Biotechnol. 27 (9), 797-799 (2009).
- Nycholat, C. M., et al. Recognition of Sialylated Poly-N-acetyllactosamine Chains on N- and O-Linked Glycans by Human and Avian Influenza A Virus Hemagglutinins. Angew Chem Int Ed Engl. , (2012).
- Rillahan, C. D., Paulson, J. C. Glycan microarrays for decoding the glycome. Annu Rev Biochem. 80, 797-823 (2011).
- Song, X., et al. A sialylated glycan microarray reveals novel interactions of modified sialic acids with proteins and viruses. J Biol Chem. 286 (36), 31610-31622 (2011).
- Gulati, S., et al. Human H3N2 Influenza Viruses Isolated from 1968 To 2012 Show Varying Preference for Receptor Substructures with No Apparent Consequences for Disease or Spread. PLoS One. 8 (6), (2013).
- Stevens, J., Blixt, O., Paulson, J. C., Wilson, I. A. Glycan microarray technologies: tools to survey host specificity of influenza viruses. Nat Rev Microbiol. 4 (11), 857-864 (2006).
- de Vries, R. P., et al. Evolution of the hemagglutinin protein of the new pandemic H1N1 influenza virus: maintaining optimal receptor binding by compensatory substitutions. J Virol. 87 (24), 13868-13877 (2013).
- Yang, H., et al. Structure and receptor binding preferences of recombinant human A(H3N2) virus hemagglutinins. Virology. 477, 18-31 (2015).
- de Vries, R. P., et al. The influenza A virus hemagglutinin glycosylation state affects receptor-binding specificity. Virology. 403 (1), 17-25 (2010).
