La recolección selectiva de leucocitos marginando-pulmonar
Summary
Marginating-pulmonary leukocytes exhibit unique characteristics and distinct immunological functions compared to other leukocyte populations. Here we describe selective harvesting of this subpopulation of pulmonary leukocytes, by forced perfusion of the lungs in rats and mice. Marginating-pulmonary leukocytes seem critical in determining susceptibility to blood-borne and lung-related diseases.
Abstract
Marginating-pulmonary (MP) leukocytes are leukocytes that adhere to the inner endothelium of the lung capillaries. MP-leukocytes were shown to exhibit unique composition and characteristics compared to leukocytes of other immune compartments. Evidence suggests higher cytotoxicity of natural killer cells, and a distinct pro- and anti-inflammatory profile of the MP-leukocyte population compared to circulating or splenic immunocytes. The method presented herein enables selective harvesting of MP-leukocytes by forced perfusion of the lungs in either mice or rats. In contrast to other methods used to extract lung-leukocytes, such as tissue grinding and biological degradation, this method exclusively yields leukocytes from the lung capillaries, uncontaminated with parenchymal, interstitial, and broncho-alveolar cells. In addition, the perfusion technique better preserves the integrity and the physiological milieu of MP-leukocytes, without inducing physiological responses due to tissue processing. This unique MP leukocyte population is strategically located to identify and react towards abnormal circulating cells, as all circulating malignant cells and infected cells are detained while passing through the lung capillaries, physically interacting with endothelial cells and resident leukocytes,. Thus, selective harvesting of MP-leukocytes and their study under various conditions may advance our understanding of their biological and clinical significance, specifically with respect to controlling circulating aberrant cells and lung-related diseases.
Introduction
Los leucocitos se adhieren a los capilares de los pulmones (es decir, marginando-pulmonar (MP) leucocitos) 1 se mostraron para exhibir composición de leucocitos distinto y actividad única en comparación con los leucocitos de otros compartimentos inmunes (por ejemplo, la circulación, el bazo, la médula ósea) 2- 4. Por ejemplo, exhiben MP-leucocitos superior natural killer (NK) citotoxicidad frente a varias células tumorales, en comparación con circulantes y esplénicas células NK, así como los niveles diferenciados de ARN mensajero (ARNm) y aumento de la secreción de citoquinas pro- y anti-inflamatorias. La composición de células también se diferencia de leucocitos circulantes como MP-leucocitos tienen una relación más alta de la inmunidad innata / adaptativa en comparación con los leucocitos circulantes (50% vs. 30%, respectivamente). El objetivo del método presentado en este documento es para permitir la recolección selectiva de MP-leucocitos, con el fin de estudiar este compartimiento inmune importante y única (población de células), y para elucidate el impacto de las diversas manipulaciones (por ejemplo, la activación inmune) en estas células específicas.
Para comprender el significado de esta población única, es importante tener en cuenta que el sistema inmune puede controlar las células tumorales, las micrometástasis, y la enfermedad residual circula a través de las funciones in vivo de la inmunidad mediada por células (CMI). Esta capacidad es evidente a pesar del fracaso precedente del sistema inmunológico para controlar el tumor primario, y apoyado por amplia en pruebas in vivo en pacientes con cáncer y en modelos animales 5. Es importante destacar que estos resultados son a menudo incompatibles con los estudios in vitro y ex vivo, que informan que la mayoría de las células tumorales autólogas son resistentes a la citotoxicidad mediante la circulación de leucocitos en muestras de sangre de seres humanos y animales (medido por ensayos de citotoxicidad) 6,7. Esta discrepancia puede ser atribuida a la existencia in vivo de poblaciones de leucocitos distintos, tales como los antesmencionada población de leucocitos MP, y concretamente su subpoblación de células NK activadas 3. De hecho, las células tumorales (singénicos MADB106), que se encontraron ser resistente a la circulación y leucocitos esplénicos, se demostró que la lisis por las células NK MP-3,8. Por lo tanto, las células supuestamente 'NK-resistentes' MADB106 que hacen metástasis a los pulmones de fischer344 ratas (F344) están controlados por las células MP-NK, pero no por las células NK esplénicas, que comúnmente se estudian dada su facilidad de acceso o circulante.
Purificado y activos MP-leucocitos son inaccesibles a través de los métodos de cosecha estándar de leucocitos de los pulmones, que se basan en la molienda tejido pulmonar o la degradación biológica 9. Nuestro enfoque tiene dos ventajas importantes en comparación con los enfoques de procesamiento de tejidos. En primer lugar, el enfoque de perfusión cosecha selectivamente MP-leucocitos, separándolas de otras células que se originan en el parénquima pulmonar, intersticial, y compar bronco-alveolartments. En segundo lugar, la técnica de perfusión mejor conserva la integridad y el medio fisiológico de MP-leucocitos, a diferencia de la molienda y el procesamiento biológico se acerca que dañan las células, alterar su morfología, e inducen la producción y liberación de diversos factores que modulan la actividad inmune y específicamente suprimen NK 10 citotoxicidad.
Los pulmones son un órgano principal objetivo para la metástasis del cáncer y para diversas enfermedades infecciosas. Todas las células malignas circulantes y células infectadas pasan a través de los capilares pulmonares, donde tienen que deformarse e interactuar con las células endoteliales de los capilares y leucocitos residentes. En estas condiciones, las células circulantes pueden ser fácilmente dirigidos por residentes MP-leucocitos. Por tanto, parece biológicamente ventajoso tener leucocitos activados en este compartimiento inmune, y es importante para estudiar este MP-población única en diferentes entornos biológicos, experimentales y clínicos. Es digno de notar que syactivación stemic inmune por varias-respuesta modificadores biológicos (por ejemplo, ácido poliinosínico-policitidílico (poli I: C) o oligodesoxinucleótidos tipo-C CpG (CpG-C ODN)) han demostrado para activar MP-leucocitos más de leucocitos circulantes 3, 8,11.
Protocol
Representative Results
Discussion
El método presentado en este documento permite la recogida selectiva y el estudio de la población única de MP-leucocitos. En comparación con los leucocitos esplénicos o circulante, la población MP se caracteriza por una composición distinta de subpoblaciones de leucocitos, los niveles de activación más altos, mayor liberación de varias citoquinas, y más altos niveles de ARNm de pro- y citocinas antiinflamatorias 2,3. Específicamente, hemos demostrado que las células MP-NK son más citotóxicos qu…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores y este trabajo fueron apoyados por NIH / NCI subvención # R01CA172138 (a SBE).
Materials
| Autoclud Peristaltic pump | |||
| Butterfly needle | OMG | 26G | |
| Butterfly needle | OMG | 21G*3/4" | |
| Syringe | Pic solution | 1 ml | |
| Syringe | Pic solution | 2.5 ml | |
| Syringe | Pic solution | 5 ml | |
| Syringe | Pic solution | 10 ml | |
| Syringe | Pic solution | 25 ml | |
| Blunted-edged forceps | |||
| Scissors | |||
| hemostat | |||
| Tissue forceps | |||
| Heparin sodium porcine mucosa (perservative free) | Sigma Aldrich |
References
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