कार्यात्मक complementation विश्लेषण (एफसीए): एक प्रयोगशाला व्यायाम डिजाइन और जैव रासायनिक रास्ते के शिक्षण के पूरक के लिए लागू
Summary
एंजाइमी जैव रासायनिक रास्ते में शामिल गतिविधियों की मान्यता कार्यात्मक पूरक विश्लेषण (एफसीए) का उपयोग कर elucidated जा सकता है। इस पांडुलिपि में वर्णित अमीनो एसिड, बैक्टीरियल कड़े प्रतिक्रिया और बैक्टीरियल पेप्टीडॉग्लीकैन जैवसंश्लेषण के चयापचय में शामिल एंजाइमों के enzymatic गतिविधि का प्रदर्शन एफसीए परख है।
Abstract
कार्यात्मक complementation परख (एफसीए) एक Vivo परख है कि व्यापक रूप से जीन / एंजाइमों के समारोह / भूमिका स्पष्ट करने के लिए प्रयोग किया जाता है। इस तकनीक जैव रसायन, आनुवंशिकी और कई अन्य विषयों में बहुत आम है। तकनीक की एक व्यापक सिंहावलोकन एसिड होता है, पेप्टीडॉग्लीकैन और बैक्टीरियल कड़े प्रतिक्रिया इस पांडुलिपि में सूचना दी है एमिनो से संबंधित जैव रासायनिक रास्ते के शिक्षण के पूरक के लिए। मॉडल संयंत्र जीव Arabidopsis thaliana कि लाइसिन (एल, एल diaminopimelate एमिनोट्रांस्फरेज (dapL) और tyrosine एमिनोट्रांस्फरेज (tyrB) tyrosine और फेनिलएलनिन के चयापचय में शामिल की चयापचय में शामिल कर रहे हैं से दो cDNAs डाला जाता है। इसके अलावा, बैक्टीरियल पेप्टीडॉग्लीकैन उपचय मार्ग पार करने में शामिल जीवाणु Verrucomicrobium spinosum से UDP- एन -acetylmuramoyl एल alanyl-D-glutamate- मेसो -2,6-diaminopimelate ligase (Mure) जीन के विश्लेषण के माध्यम से प्रकाश डाला हैपेप्टीडॉग्लीकैन की -linking। बैक्टीरियल कड़े प्रतिक्रिया भी RSH (आर इला / एस बर्तन ज omolog) bifunctional जीन जीवाणु Novosphingobium सपा में एक अति mucoid phenotype के लिए जिम्मेदार के विश्लेषण के माध्यम से सूचना दी है। एफसीए के चार उदाहरण प्रस्तुत कर रहे हैं। वीडियो उनमें से तीन पर ध्यान दिया जाएगा, अर्थात् लाइसिन, पेप्टीडॉग्लीकैन और कड़े प्रतिक्रिया।
Introduction
समारोह (एस) elucidating / एक जीन की भूमिका (ओं) के संदर्भ में कार्यात्मक पूरक एक विशेष मुताबिक़ या orthologous जीन की क्षमता जब मुताबिक़ जंगली प्रकार राज्य के लिए एक नमूदार phenotype के साथ एक विशेष उत्परिवर्ती बहाल करने के लिए के रूप में परिभाषित किया गया है या orthologous जीन उत्परिवर्ती पृष्ठभूमि में सीआईएस या ट्रांस में पेश किया है। इस तकनीक का व्यापक रूप से अलग और समारोह (एस) / कई जीनों की भूमिका (ओं) की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया गया है। एक विशिष्ट उदाहरण अलगाव और कैंडिडा सफेद से orotidine-5-फॉस्फेट decarboxylase की पहचान एस के ura3 उत्परिवर्ती का उपयोग कर रहा है cerevisiae और ई की pyrF उत्परिवर्ती कोलाई। 1 लेखकों जीन है कि अमीनो एसिड, पेप्टीडॉग्लीकैन और उनके शोध कार्यक्रमों में कड़े प्रतिक्रिया के चयापचय में शामिल कर रहे हैं और 'बी' में उनके शिक्षण कार्यक्रमों में इस तकनीक को शामिल किया है के समारोह को स्पष्ट करने के लिए इस तकनीक का इस्तेमाल किया हैiotechnology और आण्विक बायोसाइंस (बीएमबी) Rochester प्रौद्योगिकी संस्थान (RIT) पर कार्यक्रम।
सिद्धांत और व्यवहार (बीपीपी) (हडसन / Savka), आरआईटी में बीएमबी कार्यक्रम में दो उच्च श्रेणी वैकल्पिक प्रयोगशाला आधारित पाठ्यक्रम: लेखकों संयंत्र जैव रसायन / पैथोलॉजी (FPBP) (हडसन) और Bioseparations के मूल सिद्धांतों सिखाना। चूंकि विषय है कि पाठ्यक्रम में चर्चा कर रहे हैं में से कुछ अपने अनुसंधान के हितों के साथ संबद्ध हैं, लेखकों तकनीक और प्रयोगात्मक उपकरण है कि इन दोनों प्रयोगशाला आधारित पाठ्यक्रमों में उनके संबंधित अनुसंधान कार्यक्रमों में इस्तेमाल कर रहे हैं के कई शामिल किया है। ऐसा ही एक उदाहरण एक प्रयोगशाला व्यायाम पौधों, पेप्टीडॉग्लीकैन और बैक्टीरिया से कठोर प्रतिक्रिया के चयापचय से एसिड चयापचय एमिनो से संबंधित व्याख्यान सामग्री को सुदृढ़ करने के रूप में कार्य पूरक है।
कि FPBB पाठ्यक्रम में चर्चा कर रहे हैं पौधों से अमीनो एसिड रास्ते में से तीन हैं कि लाइसिन (प्रकाश) की, tyrosine(Tyr) और फेनिलएलनिन (पीएचई)। लिस मार्ग सभी जानवरों को विशेष रूप से मनुष्य के लिए एक आवश्यक अमीनो एसिड के रूप में अमीनो एसिड के महत्व की वजह से पाठ्यक्रम में प्रकाश डाला है क्योंकि जानवरों के संश्लेषण के लिए नए सिरे से प्रकाश आनुवंशिक मशीनरी की कमी है। इसके अलावा, यह हाल ही में पता चला था कि पौधों प्रकाश संश्लेषण की कि बैक्टीरिया के उस से काफी अलग है के लिए एक मार्ग को रोजगार। इस खोज को आंशिक रूप से ई के कार्यात्मक पूरक द्वारा मदद की थी कोलाई diaminopimelate (डीएपी) एक जीन है कि मॉडल संयंत्र Arabidopsis thaliana से एंजाइम एल, एल diaminopimelate एमिनोट्रांस्फरेज (DapL) encodes का उपयोग कर म्यूटेंट। 2 मध्यवर्ती diaminopimelate के माध्यम से प्रकाश के संश्लेषण के लिए संस्करण रास्ते चित्र 1 में दिखाया गया है। इसके अलावा , प्रकाश संश्लेषण की एमिनो एसिड की aspartate निकाली गई जो परिवार अत्यधिक नियंत्रित किया जाता है के माध्यम से की सुविधा। 3 प्रोटीन SYNT में उनके महत्व के अलावाhesis, Tyr और पीएचई के लिए रास्ते phenylpropanoid यौगिकों के उपचय के लिए अग्रदूत यौगिकों के रूप में सेवा करने में उनके महत्व को देखते हुए डाला जाता है जैसे संयंत्र रक्षा यौगिकों के संश्लेषण शामिल:। alkaloids, lignins, flavonoids, isoflavonoids, दूसरों के बीच hydroxycinnamic एसिड 4 tyr और पीएचई रास्ते भी संयंत्र और बैक्टीरियल उपचय रास्ते के बीच अंतर दिखाने के लिए डाला जाता है। बैक्टीरिया में, एंजाइम tyrosine एमिनोट्रांस्फरेज (TyrB), दोनों अमीनो एसिड के उपचय में शामिल है, जबकि पौधों में, एंजाइम मुख्य रूप से tyr और पीएचई के अपचय में शामिल है और इन एमिनो एसिड की उपचय में शामिल नहीं किया जाता है। (चित्रा 2)। 4
ग्राम पॉजिटिव और ग्राम पेप्टीडॉग्लीकैन (पीजी) की संरचना के बारे में नकारात्मक बैक्टीरिया के बीच मतभेद FPBP पाठ्यक्रम में डाला जाता है। ग्राम नकारात्मक बैक्टीरिया के पीजी तथ्य के आधार पर प्लांट पैथोलॉजी के बारे में ब्याज की है कि सबसे अधिकसंयंत्र रोगजनकों ग्राम नकारात्मक हैं। शीर्ष 10 बैक्टीरियल पादप रोगजनकों के बारे में हाल ही में एक समीक्षा से पता चला है कि सभी ग्राम नकारात्मक हैं। बैक्टीरिया पीढ़ी से थे। स्यूडोमोनास, Ralstonia, एग्रोबैक्टीरियम, Xanthomonas, अर्विनिआ, Xylella, Dickeya और Pectobacterium रासायनिक मतभेद के 5 से एक है जब ग्राम नकारात्मक और ग्राम पॉजिटिव बैक्टीरिया की पीजी स्टेम की तुलना पार से जोड़ने एमिनो के बीच का अंतर है दोनों प्रकार का एसिड। पीजी की है कि अलग अलग पार से जोड़ने के लिए प्रारंभिक कदम पीजी उपचय के cytoplasmic कदम में होता है और एंजाइम UDP- एन -acetylmuramoyl एल alanyl-D-glutamate- मेसो -2,6-diaminopimelate ligase से मदद की है (Mure) (चित्रा 3 ए)। Mure। पेप्टाइड स्टेम के तीसरे नंबर 6 पर एक विशेष यौगिक Diamine सबसे ग्राम नकारात्मक बैक्टीरिया के अलावा उत्प्रेरित, अंत से पहले प्रकाश अग्रदूत, मेसो -diaminopimelate ( <eM> मीटर -DAP) के रूप में कार्य करता है पार से जोड़ने एमिनो एसिड और लिस सबसे ग्राम पॉजिटिव बैक्टीरिया की पीजी (चित्रा 3 बी) में वही भूमिका में कार्य करता है। 7 इस तथ्य के कारण है कि दोनों मीटर -DAP और लिस दो अमाइन अधिकारी समूहों और पेप्टाइड स्टेम पार से जोड़ने के लिए दो पेप्टाइड बांड बनाने में सक्षम हैं।
Bioseparations में: सिद्धांत और व्यवहार (बीपीपी) बेशक, पर्यावरण परिवर्तन के कारण बैक्टीरिया की खेती और कैसे पोषक तत्वों का स्तर दोनों प्रणालियों में काफी बदल जाएगा के लिए खुले और बंद प्रणालियों के बीच मतभेदों को चर्चा कर रहे हैं। इन घटनाओं विनियामक परिवर्तन नामक एक "नीचे बदलाव" या "ऊपर पाली" से जुड़े होते हैं भुखमरी या अमीनो एसिड या ऊर्जा की पर्याप्त आपूर्ति से शुरू हो गया। "नीचे शिफ्ट" प्रतिक्रिया हो सकता है जब एक जीवाणु संस्कृति एक भी कार्बन स्रोत के साथ एक रासायनिक परिभाषित मध्यम करने के लिए एक समृद्ध और जटिल मध्यम से स्थानांतरित कर रहा है। वातावरण में यह परिवर्तन तेजी से cessa की ओर जाता हैtRNA और rRNA संश्लेषण की tion। राइबोसोम, प्रोटीन और डीएनए संश्लेषण की कमी भले ही अमीनो एसिड के biosynthesis upregulated रहे हैं में इस समापन का परिणाम है।
"नीचे शिफ्ट" प्रतिक्रिया के बाद, मौजूदा राइबोसोम अमीनो एसिड नहीं रह मध्यम या वातावरण में उपलब्ध के संश्लेषण के लिए नए एंजाइमों का उत्पादन करने के लिए उपयोग किया जाता है। समय की अवधि के बाद, rRNA संश्लेषण और नए राइबोसोम इकट्ठा कर रहे हैं और बैक्टीरियल कोशिकाओं की आबादी एक कम दर पर हालांकि विकसित करने के लिए शुरू होता है। घटनाओं के पाठ्यक्रम "कड़े प्रतिक्रिया" या "कड़े नियंत्रण" करार दिया और वैश्विक सेलुलर विनियमन का एक उदाहरण है और आवश्यक substrates और ऊर्जा जरूरतों की उपलब्धता के लिए क्षतिपूर्ति करने के लिए सेल के biosynthetic मशीनरी को एडजस्ट करने के लिए एक तंत्र के रूप में सोचा जा सकता है । 8 कड़े प्रतिक्रिया इस प्रकार के माहौल में पोषक तत्वों की अपशिष्टों के लिए तेजी से प्रतिक्रिया करने में सक्षम बनाता है और बैक्टीरिया योगदान देता है और ENHवातावरण में प्रतिस्पर्धा करने के लिए है कि तेजी से पोषक तत्व और या सब्सट्रेट उपलब्धता के संबंध के साथ बदल सकते हैं बैक्टीरिया की क्षमता ances। 8-9
कड़े प्रतिक्रिया जीन अभिव्यक्ति में एक अभिन्न भूमिका जब अमीनो एसिड, कार्बन, नाइट्रोजन, फॉस्फेट, और फैटी एसिड की उपलब्धता सीमित कर रहे हैं। 8,10-14 इस कड़े प्रतिक्रिया दो न्यूक्लियोटाइड, guanosine tetraphosphate (ppGpp) और guanosine द्वारा समन्वित है pentaphosphate (pppGpp) आमतौर पर alarmone (पी) ppGpp रूप में एक साथ भेजा। उदाहरण के लिए, जब अमीनो एसिड सीमित जो कर रहे हैं प्रोटीन संश्लेषण-alarmone में एक अड़चन पैदा कर सकते हैं, guanosine 3,5- (बीआईएस) पायरोफ़ॉस्फ़ेट (ppGpp), guanosine 3-diphosphate 5-triphosphate की उपचय से निकाली गई (pppGpp) जम सेल में। (पी) ppGpp स्तर में परिवर्तन जीन है कि प्रतिक्रिया को विनियमित वातावरण में substrates कि सीधे सेल के विकास और शहरी में शामिल कर रहे हैं की कमी को दूर करने के लिए की अभिव्यक्ति में शामिल हैटी। जीन है कि इस प्रक्रिया में शामिल कर रहे हैं के दो असली और स्पॉट कहा जाता है। असली एक राइबोसोम जुड़े (पी) ppGpp synthetase कि uncharged tRNAs के संचय एमिनो एसिड सीमा का परिणाम है कि करने के लिए प्रतिक्रिया में शामिल किया जाता है। एक bifunctional (पी) ppGpp synthetase और hydrolase के रूप में स्पॉट कार्य करता है। स्पॉट की synthetase गतिविधि कार्बन और फैटी एसिड भुखमरी की कमी के जवाब में शामिल है। 8 असली / स्पॉट homologs पौधों और बैक्टीरिया में बड़े पैमाने पर कर रहे हैं और आर इला / एस बर्तन ज omologs के लिए Rsh के रूप में करने के लिए भेजा जाता है। 8,10 -12,16 हाल ही में एक पांडुलिपि से पता चला है एक विशिष्ट Rsh प्रोटीन जीवाणु Novosphingobium सपा आर आर 2-17 से इन alarmones के संश्लेषण में शामिल नहीं है। 17
यहाँ हम कार्यात्मक पूरक assays के लिए सीमित चार जैव रासायनिक रास्ते प्रस्तुत करते हैं। पूरक इस पांडुलिपि में उल्लिखित assays expl करने के लिए एक अवसर प्रदान करता हैअयस्क की पहचान करने और या एंजाइमों कि अज्ञात / ख्यात समारोह (s) या शिक्षण उपकरण जैव रासायनिक रास्ते के शिक्षण के पूरक के रूप में राशि की भविष्यवाणी कर रहे निस्र्पक के एक साधन के रूप में इस विवो परख काम करते हैं।
Protocol
Representative Results
Discussion
पाठ्यक्रम कि Rochester प्रौद्योगिकी संस्थान में जैव प्रौद्योगिकी और आणविक बायोसाइंस पाठ्यक्रम का अभिन्न अंग हैं में से कई पाठ्यक्रम के व्याख्यान हिस्से के अलावा एक प्रयोगशाला घटक है। शैक्षणिक वर्ष 2014-2015 क?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
AOH और मास विज्ञान के कॉलेज और थॉमस एच Gosnell समर्थन के लिए Rochester प्रौद्योगिकी संस्थान में लाइफ साइंसेज के स्कूल मानता है। इस काम में संयुक्त राज्य अमेरिका के राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन (NSF) AOH एमसीबी-1,120,541 को यह पुरस्कार द्वारा समर्थित किया गया था।
Materials
| E. coli mutants | Hudson/Savka lab or CGSC (http://cgsc.biology.yale.edu/) | |
| Electroporator | Biorad-USA | 1652100 |
| Electroporation Cuvettes | Biorad-USA | 1652082 |
| Temperature controlled incubator | Generic | |
| Microcentrifuge | Generic | |
| Luria Agar | Thermofisher Scientific | 22700025 |
| Luria Broth | Thermofisher Scientific | 12795084 |
| M9 Medium | Sigma-Aldrich | 63011 |
| Potato Dextrose Medium | Fisher Scientfic | DF0013-15-8 |
| Kanamycin | Sigma-Aldrich | K1377 |
| Diaminopimelate | Sigma-Aldrich | 92591 |
| Thymine | Sigma-Aldrich | T0376 |
| Chloramphenicol | Sigma-Aldrich | C0378 |
| Tyrosine | Sigma-Aldrich | T3754 |
| Phenlylalanine | Sigma-Aldrich | P2126 |
| Aspartate | Sigma-Aldrich | A9256 |
| Valine | Sigma-Aldrich | V0500 |
| Leucine | Sigma-Aldrich | L8000 |
| Isoleucine | Sigma-Aldrich | I2752 |
| Uracil | Sigma-Aldrich | U0750 |
| Gylcerol | Sigma-Aldrich | G5516 |
| Arabinose | Sigma-Aldrich | A3256 |
| Tetracyline | Sigma-Aldrich | 87128 |
| Taq DNA polymerase | Thermofisher Scientific | 10342-020 |
| Platinum pfx DNA polymerase | Thermofisher Scientific | 11708-013 |
| T4 DNA ligase | Thermofisher Scientific | 15224-041 |
| E coli Dh5-alpha | Thermofisher Scientific | 18258012 |
| E coli Top10 | Thermofisher Scientific | C4040-03 |
| pET100D/topo vector | Thermofisher Scientific | K100-01 |
| pCR2.1 Vector | Thermofisher Scientific | K2030-01 |
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