Análise Funcional Complementação (FCA): Um Exercício Laboratório concebido e implementado para complementar o Ensino de Bioquímica Pathways
Summary
A validação de actividades enzimáticas envolvidas nas vias bioquímicas podem ser elucidada utilizando a análise de complementação funcional (FCA). Descritos neste manuscrito é o ensaio de FCA que demonstra a actividade enzimática de enzimas envolvidas no metabolismo de aminoácidos, resposta rigorosas bacteriana e biossíntese bacteriana do peptidoglicano.
Abstract
Ensaio de complementação funcional (FCA) é um ensaio in vivo que é amplamente utilizado para elucidar a função / função de genes / enzimas. Esta técnica é muito comum em bioquímica, genética e muitas outras disciplinas. Uma visão abrangente da técnica para complementar o ensino de vias bioquímicas que pertencem aos aminoácidos, peptidoglicano e da resposta rigorosa bacteriana é relatado neste manuscrito. Dois ADNc do thaliana organismo modelo Arabidopsis planta que estão envolvidas no metabolismo de lisina (L, aminotransferase L-diaminopimelato (dapL) e tirosina aminotransferase (tyrB) envolvida no metabolismo da tirosina e fenilalanina são realçados. Além disso, o peptidoglicano bacteriano via anabólico é realçada por meio da análise da -acetylmuramoyl-L-alanil-D-meso-ligase glutamate- -2,6-diaminopimelato (mûre) gene UDP-N a partir da bactéria Verrucomicrobium spinosum envolvido na transversal-linking de peptidoglicano. A resposta rigorosa bacteriana também é relatado por meio da análise do rsh (R ela / s Pot h omolog) gene bifuncional responsável por um fenótipo hiper-mucóide na sp bactéria Novosphingobium. Quatro exemplos de FCA são apresentados. O vídeo vai se concentrar em três deles, ou seja, lisina, peptidoglicano e da resposta rigorosa.
Introduction
complementação funcional no contexto da elucidação da função (s) / papel (s) de um gene é definido como a capacidade de um homólogo particular ou gene ortólogo para restaurar um mutante particular com um fenótipo observável para o estado de tipo selvagem quando o homólogo ou gene ortólogo é introduzido na forma cis ou trans para o fundo mutante. Esta técnica tem sido amplamente utilizado para isolar e identificar a função (s) / papel (s) de vários genes. Um exemplo particular é o isolamento e identificação de descarboxilase orotidina-5-fosfato a partir de Cândida albicans utilizando o mutante URA3 de S. cerevisiae e o mutante pyrF de E. coli. 1 Os autores têm utilizado esta técnica para elucidar a função dos genes que estão envolvidos no metabolismo de aminoácidos, peptidoglicano e a resposta rigorosa em seus programas de pesquisa e incorporaram esta técnica em seus programas de ensino do Biotechnology e programa do Rochester Institute of Technology (RIT) Bioscience Molecular (BMB).
Os autores ensinam Fundamentos de Bioquímica / Patologia (FPBP) (Hudson) e Bio Separação: Princípios e Práticas (BPP) (Hudson / Savka), dois cursos baseados superior divisão laboratório eletiva no Programa BMB na RIT. Desde alguns dos temas que são discutidos nos cursos são filiados com seus interesses de pesquisa, os autores têm incorporado muitas das técnicas e ferramentas experimentais que são usados em seus programas de investigação para estes dois cursos em laboratório. Um tal exemplo é a complementação funcional, tal como um exercício de laboratório para reforçar os materiais de aula pertencentes aos amino metabolismo do ácido a partir de plantas, de peptidoglicano e o metabolismo resposta rigorosa a partir de bactérias.
Três das vias de aminoácidos de plantas que são discutidos no curso FPBB são o de lisina (Lys), tirosina(Tyr) e fenilalanina (Phe). A via de Lys é realçada no curso, devido à importância de o aminoácido como um aminoácido essencial para todos os animais particularmente em seres humanos dado que os animais não possuem a maquinaria genética para sintetizar de novo Lys. Além disso, foi recentemente descoberto que as plantas utilizam uma via para a síntese de Lys, que é significativamente diferente da das bactérias. Esta descoberta foi parcialmente facilitada pela complementação funcional da E. diaminopimelato coli (DAP) mutantes que utilizam um gene que codifica a enzima L, L-diaminopimelato aminotransferase (DapL) do thaliana modelo da planta Arabidopsis. 2 As vias variantes para a síntese de Lys através da diaminopimelato intermédia são mostrados na Figura 1. Além disso , a síntese de Lys facilita através do aspartato derivado da família de aminoácidos que é altamente regulado. 3 para além da sua importância na proteína Synthesis, as vias para Tyr e Phe são destacadas por sua importância para servir como compostos precursores para o anabolismo de compostos fenilpropanóides envolveu a síntese de compostos de defesa da planta, tais como:. alcalóides, ligninas, flavonóides, isoflavonas, ácido hidroxicinâmico entre outros 4 O Tyr e as vias de phe também são destacados para mostrar a diferença entre a central e as vias anabólicas bacterianas. Em bactérias, o aminotransferase enzima tirosina (TyrB) está envolvida no anabolismo de ambos os ácidos aminados, enquanto que nas plantas, é a enzima primariamente envolvidas no catabolismo de Tyr e Phe e não está envolvida no anabolismo destes aminoácidos. (Figura 2). 4
As diferenças entre Gram positivas e Gram negativas em relação à estrutura do peptidoglicano (PG) são destacadas no curso FPBP. O PG de bactérias Gram-negativas é de interesse em relação a patologia vegetal baseado em ao facto de a maioriapatógenos de plantas são gram negativa. Uma revisão recente sobre os 10 melhores fito-patógenos bacterianos revelou que todos são Gram negativo. As bactérias eram de entre os géneros Pseudomonas, Ralstonia, Agrobacterium, Xanthomonas, Erwinia, Xylella, Dickeya e Pectobacterium 5 Uma das diferenças químicas quando comparando a haste de PG de bactérias positivas negativas e Gram Gram é a diferença entre o grupo amino de ligação cruzada. ácidos de ambos os tipos. O passo inicial para que a ligação cruzada diferente de PG ocorre na etapa citoplasmática de PG anabolismo e é facilitada por a enzima UDP-N–acetylmuramoyl-L-alanil-D glutamate- meso-ligase -2,6-diaminopimelato (mûre) (Figura 3A). Mûre catalisa a adição de um composto de diamina nomeadamente em terceira posição da haste péptido. 6 Na maioria das bactérias Gram-negativas, os Lys penúltimo precursor, meso -diaminopimelate ( <em> m -DAP) serve como a reticulação de aminoácidos Lys e serve a mesma função no PG da maioria das bactérias Gram-positivas (Figura 3B). 7 Isto é devido ao facto de que ambos m e -DAP Lys possuem dois amina e os grupos são capazes de formar duas ligações peptídicas para a haste péptido reticulação.
Nos Bio Separação: Princípios e Práticas de curso (BPP), as diferenças entre os sistemas abertos e fechados para o cultivo de bactérias e como nutriente níveis mudará significativamente em ambos os sistemas, devido às mudanças ambientais são discutidas. Estes eventos estão ligados a mudanças regulatórias chamado de "deslocar para baixo" ou "deslocar-se" desencadeada pela fome ou uma oferta adequada de aminoácidos ou de energia. A resposta de "mudança para baixo" pode ocorrer quando uma cultura bacteriana é transferida a partir de um meio rico e complexo para um meio definido quimicamente com uma única fonte de carbono. Esta mudança no ambiente leva à rápida cessação da síntese de ARNt e ARNr. Esta cessação resulta na falta de ribossomas, proteína e síntese de ADN embora a biossíntese de aminoácidos são regulados positivamente.
Na sequência da resposta "deslocar para baixo", os ribossomos existentes são usadas para produzir novas enzimas para sintetizar os aminoácidos não disponíveis no meio ou ambiente. Depois de um período de tempo, a síntese de rRNA e novas ribossomas são montados e a população de células bacterianas começa a crescer, embora a uma taxa reduzida. O curso dos acontecimentos é denominado o "resposta rigorosas" ou "controlo rigoroso" e é um exemplo de regulação celular global e pode ser pensado como um mecanismo para ajustar maquinaria biossintética da célula para compensar a disponibilidade dos substratos necessários e as necessidades de energia . 8 a resposta rigorosa permite, assim, as bactérias de responder rapidamente a fluxos de nutrientes no meio ambiente e contribui ea ENHANCES a capacidade das bactérias para competir em ambientes que podem mudar rapidamente com relação aos nutrientes e ou disponibilidade de substrato. 8-9
A resposta rigorosas tem um papel integral na expressão do gene quando a disponibilidade de aminoácidos, carbono, azoto, fosfato e ácidos gordos são limitados. 8,10-14 Esta resposta rigorosa é coordenado por dois nucleótidos, tetrafosfato de guanosina (ppGpp) e guanosina pentafosfato (pppGpp) vulgarmente designado em conjunto, como o alarmone (p) ppGpp. Por exemplo, quando os aminoácidos estão limitados-o que pode levar a um gargalo na síntese de proteína-a alarmone, guanosina 3,5- (bis) pirofosfato (ppGpp), derivado de anabolismo de guanosina-difosfato 3 5-trifosfato (pppGpp) acumula na célula. A mudança no nível (p) ppGpp está envolvida na expressão de genes que regulam a resposta para superar a falta de substratos no ambiente que estão diretamente envolvidos no crescimento celular e development. Dois dos genes que estão envolvidos neste processo são chamados relA e local. RelA é uma (P) ppGpp sintetase associada ao ribossoma que está envolvido na resposta à acumulação de ARNt que não carregados é o resultado de limitação de aminoácidos. funções de ponto como um bifuncional (p) ppGpp sintetase e hidrolase. A actividade da sintetase da mancha está envolvido na resposta à falta de carbono e ácido graxo fome. 8 Os homólogos RelA / local são comuns em plantas e bactérias e são referidos como Rsh para R ELA / S da panela H omologs. 8,10 -12,16 um manuscrito recente mostrou que há uma proteína Rsh específica envolvida na síntese destes alarmones a partir da bactéria Novosphingobium sp Rr 17/02 17.
Aqui nós apresentamos quatro vias bioquímicas amarrados aos ensaios de complementação funcional. Os ensaios de complementação descritos neste manuscrito fornece uma avenida para explminério utilizando este ensaio in vivo como um meio de identificar e caracterizar ou enzimas que estão previstos para ter função desconhecida / putativo (s) ou como ferramentas de ensino para complementar o ensinamento das vias bioquímicas.
Protocol
Representative Results
Discussion
Muitos dos cursos que são parte integrante da Biotecnologia e currículo Molecular Bioscience no Instituto de Tecnologia de Rochester têm uma componente laboratorial, além da parte de leitura do curso. O currículo para o ano lectivo 2014-2015 contém um total de 48 cursos, 29 dos quais contêm um componente laboratorial que representam aproximadamente 60%. Um tal curso é Fundamentos de Bioquímica e Patologia (FPBP), um curso de blended aula / laboratório e Bio Separação: Princípios e Práticas (BPP), um curso …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
AOH e MAS reconhece a Faculdade de Ciências e da Thomas H. Gosnell Escola de Ciências da Vida no Instituto de Tecnologia de Rochester para o apoio. Este trabalho foi apoiado em parte pela United States National Science Foundation (NSF) prêmio para AOH MCB-1120541.
Materials
| E. coli mutants | Hudson/Savka lab or CGSC (http://cgsc.biology.yale.edu/) | |
| Electroporator | Biorad-USA | 1652100 |
| Electroporation Cuvettes | Biorad-USA | 1652082 |
| Temperature controlled incubator | Generic | |
| Microcentrifuge | Generic | |
| Luria Agar | Thermofisher Scientific | 22700025 |
| Luria Broth | Thermofisher Scientific | 12795084 |
| M9 Medium | Sigma-Aldrich | 63011 |
| Potato Dextrose Medium | Fisher Scientfic | DF0013-15-8 |
| Kanamycin | Sigma-Aldrich | K1377 |
| Diaminopimelate | Sigma-Aldrich | 92591 |
| Thymine | Sigma-Aldrich | T0376 |
| Chloramphenicol | Sigma-Aldrich | C0378 |
| Tyrosine | Sigma-Aldrich | T3754 |
| Phenlylalanine | Sigma-Aldrich | P2126 |
| Aspartate | Sigma-Aldrich | A9256 |
| Valine | Sigma-Aldrich | V0500 |
| Leucine | Sigma-Aldrich | L8000 |
| Isoleucine | Sigma-Aldrich | I2752 |
| Uracil | Sigma-Aldrich | U0750 |
| Gylcerol | Sigma-Aldrich | G5516 |
| Arabinose | Sigma-Aldrich | A3256 |
| Tetracyline | Sigma-Aldrich | 87128 |
| Taq DNA polymerase | Thermofisher Scientific | 10342-020 |
| Platinum pfx DNA polymerase | Thermofisher Scientific | 11708-013 |
| T4 DNA ligase | Thermofisher Scientific | 15224-041 |
| E coli Dh5-alpha | Thermofisher Scientific | 18258012 |
| E coli Top10 | Thermofisher Scientific | C4040-03 |
| pET100D/topo vector | Thermofisher Scientific | K100-01 |
| pCR2.1 Vector | Thermofisher Scientific | K2030-01 |
References
- Gillum, A. M., Tsay, E. Y., Kirsch, D. R. Isolation of the Candida albicans gene for orotidine-5′-phosphate decarboxylase by complementation of S. cerevisiae ura3 and E. coli pyrF mutations. Mol Gen Genet. 198, 179-182 (1984).
- Hudson, A. O., Singh, B. K., Leustek, T., Gilvarg, C. An L,L-diaminopimelate aminotransferase defines a novel variant of the lysine biosynthesis pathway in plants. Plant Physiol. 140, 292-301 (2006).
- Jander, G., Joshi, V., Last, R. L. Aspartate-derived amino acid biosynthesis in Arabidopsis thaliana. The Arabidopsis Book. , (2009).
- Prabhu, P., Hudson, A. O. Identification and partial characterization of an L-Tyrosine aminotransferase from Arabidopsis thaliana. Biochemistry Research International. , 549572 (2010).
- Mansfield, J., Genin, S., Magori, S., Citovsky, V., Sriariyanum, M., Ronald, P., Dow, M., Verdier, V., Beer, S. V., Machado , M. A., Toth, I., Salmond, G., Foster, G. D. Top 10 pathogenic bacteria in molecular pathology. Molecular Plant Pathology. 13, 614-629 (2012).
- McGroty, S. E., Pattaniyil, D. T., Patin, D., Blanot, D., Ravichandran, A. C., Suzuki, H., Dobson, R. C., Savka, M. A., Hudson, A. O. Biochemical Characterization of UDP-N-acetylmuramoyl-L-alanyl-D-glutamate: meso-2,6-diaminopimelate ligase (MurE) from Verrucomicrobium spinosum DSM 4136T. PLoS ONE. 8 (6), e66458 (2013).
- Hutton, C. A., Perugini, M. A., Gerrard, J. A. Inhibition of lysine biosynthesis: an evolving antibiotic strategy. Mol Biosyst. 3, 458-465 (2007).
- Potrykus, K., Cashel, M. (p)ppGpp: still magical. Annu Rev Microbiol. 62, 35-51 (2008).
- Dalebroux, Z. D., Svensson, S. L., Gaynor, E. C., Swanson, M. S. ppGpp Conjures Bacterial Virulence. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 74, 171-199 (2010).
- Cashel, M., Gentry, D. J., Hernandez, V. J., Vinella, D., Neidhardt, F. C., Curtiss, R., Ingraham, J. L., Lin, E. C. C., Low, K. B., Magasanik, B., Reznikoff, W. S., Riley, M., Schaechter, M., Umbarger, H. E. The stringent response. Escherichia coli and Salmonella typhimurium: cellular and molecular biology. , 1458-1496 (1996).
- Chatterji, D., Ojha, A. K. Revisiting the stringent response, ppGpp and starvation signaling. Curr. Opin. Microbiol. 4, 160-165 (2001).
- Jain, V., Kumar, M., Chatterji, D. ppGpp: stringent response and survival. J. Microbiol. 44, 1-10 (2006).
- Kramer, G. F., Baker, J. C., Ames, B. N. Near-UV stress in Salmonella typhimurium: 4-thiouridine in tRNA, ppGpp, and pppGpp as components of an adaptive response. J. Bacteriol. 170, 2344-2351 (1988).
- Braeken, K., Moris, M., Daniels, R., Vanderleyden, J., Michiels, J. New horizons for (p)ppGpp in bacterial and plant physiology. Trends Microbiol. 14, 45-54 (2006).
- Joseleau-Petit, D., Vinella, D., D’Ari, R. Metabolic alarms and cell division in Escherichia coli. J. Bacteriol. 181, 9-14 (1999).
- Mittenhuber, G. Comparative genomics and evolution of genes encoding bacterial (p) ppGpp synthetases/hydrolases (the Rel, RelA, and SpoT proteins). J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 3, 585-600 (2001).
- Gan, H. M., Buckley, L., Szegedi, E., Hudson, A. O., Savka, M. A. Identification of an rsh Gene from a Novosphingobium sp. Necessary for Quorum-Sensing Signal Accumulation. J. Bacteriol. 191, 2551-2560 (2009).
- Nachar, V. R., Savka, F. C., McGroty, S. E., Donovan, K. A., North, R. A., Dobson, R. C., Buckley, L. J., Hudson, A. O. Genomic and biochemical analysis of the diaminopimelate and lysine biosynthesis pathway in Verrucomicrobium spinosum: Identification and partial characterization of L,L-diaminopimelate aminotransferase and UDP-N-acetylmuramoylalanyl-D-glutamyl-2,6-meso-diaminopimelate ligase. Front. Microbiol. 3, 183 (2012).
- Hudson, A. O., Giròn, I., Dobson, R. C. J. Crystallization and preliminary X-ray diffraction analysis of L,L-diaminopimelate aminotransferase (DapL) from Chlamydomonas reinhardtii. Acta Cryst. 67, 140-143 (2011).
- Dobson, R. C. J., Gir òn, I., Hudson, A. O. L,L-Diaminopimelate Aminotransferase from Chlamydomonas reinhardtii: A Target for Algaecide Development. PLoS ONE. 6 (5), e20439 (2011).
- Guzman, L. M., Belin, D., Carson, M. J., Beckwith, J. Tight regulation, modulation, and high-level expression by vectors containing the arabinose pBAD promoter. J. Bacteriol. 177, 4121-4130 (1995).
- Sambrook, J., Russell, D. W. . Molecular Cloning: A laboratory manual. , (2001).
- Lugtenberg, E. J., van Schijndel-van Dam, A. Temperature-sensitive mutants of Escherichia coli K-12 with low activity of the diaminopimelic acid adding enzyme. J. Bacteriol. 110, 41-46 (1972).
- Mavrides, C., Orr, W. Multispecific aspartate and aromatic amino acid aminotransferases in Escherichia coli. J. Biol Chem. 250, 4128-4133 (1975).
- Gelfand, D. H., Steinberg, R. A. Escherichia coli mutants deficient in the aspartate and aromatic amino acid aminotransferases. J. Bacteriol. 130, 429-440 (1977).
- Whitaker, R. J., Gaines, C. G., Jensen, R. A. A multispecific quintet of aromatic aminotransferases that overlap different biochemical pathways in Pseudomonas aeruginosa. J. Biol Chem. 257, 13550-13556 (1982).
- Raskin, D. M., Judson, N., Mekalanos, J. J. Regulation of the stringent response in the essential function if the conserved bacterial G protein CgtA in Vibrio cholera. Proc Natl Acad Sci, USA. 104, 4636-4641 (2007).
- Ditta, G., Stanfield, S., Corbin, D., Helinski, D. R. Broad host range DNA cloning system for Gram-negative bacteria: construction of a gene bank of Rhizobium meliloti. Proc Natl Acad Sci, USA. 77, 7347-7351 (1980).
- Watanabe, A., Suzuki, M., Ujiie, S., Gomi, K. Purification and enzymatic characterization of a novel β-1,6-glucosidase from Aspergillus oryzae. J Biosci Bioeng. , (2015).
- Song, J. T., Lu, H., McDowell, J. M., Greenberg, J. T. A key role for ALD1 in activation of local and systemic defenses in Arabidopsis. Plant J. 40, 200-212 (2004).
- Rost, B., Liu, J., Nair, R., Wrzeszczynski, K. P., Ofran, Y. Automatic prediction of protein function. Celuular and Molecular Life Sciences. 60, 2637-2650 (2003).
- Norris, S. R., Shen, X., Penna, D. D. Complementation of the Arabidopsis pds1 mutation with the gene encoding p-Hyrdoxyphenylpyruvate dioxygenase. Plant Physiol. 117, 1317-1323 (1998).
- Mohler, W. A., Blau, H. M. Gene expression and cell fusion analyzed by lacZ complementation in mammalian cells. Proc Natl Acad Sci, USA. 93, 12423-12427 (1996).
