תקנה אפיגנטיים של לב בידול בתאי גזע עובריים ורקמות
Summary
תקנת כוונון עדינה של שעתוק גנים בבסיס החלטת גורל תא עוברי. בזאת, אנו מתארים מבחני immunoprecipitation הכרומטין לשמש כדי לחקור תקנה אפיגנטיים של שני בידול הלב של תאי גזע ופיתוח הלב של עוברי עכברים.
Abstract
שעתוק גנים ספציפית הוא תהליך ביולוגי מפתח העומד בבסיס החלטת גורל תא במהלך התפתחות עוברית. התהליך הביולוגי מתווך על ידי גורמי תעתוק אשר נקלטים אזורי רגולטוריים הגנומי כוללים משפר ומקדם של גני מכונן לב. DNA הוא כרוך סביב ההיסטונים כי הם נתונים שינויים כימיים. שינויים של היסטונים נוסף להוביל שעתוק גנים מודחק, מופעל או שקול, ובכך להביא לרמה אחרת של רגולצית כוונון העדינה של שעתוק גנים. תאי גזע עובריים (תאי גזע עובריים) שיסכמו בתוך גופי embryoid (כלומר, אגרגטים תא) או בתרבות 2D השלבים המוקדמים של פיתוח לב. הם מספקים חומר העיקרון מספיק immunoprecipitation הכרומטין (שבב), טכנולוגיה בשימוש נרחב לזהות אזורים רגולטוריים הגן. יתר על כן, בתאי גזע עובריים אנושיים מייצגים מודל תאים אנושי של cardiogenesis. בשלבים מאוחרים יותר של ההתפתחות, רקמות עובריות העכבר לאפשרחוקר נופים אפיגנטיים ספציפיים הדרושים לצורך קביעת זהות תא. בזאת, אנו מתארים פרוטוקולים של שבב, שבב רציף ואחריו PCR או שבב רצף באמצעות תאי גזע עובריים, גופי embryoid ואזורים עובריים ספציפיים לב. פרוטוקולים אלה מאפשרים לחקור את הרגולציה אפיגנטיים של שעתוק גני לב.
Introduction
הלב הוא האיבר הראשון להיווצר להיות פונקציונלי בעובר. הלב בנוי שושלות תאים רבות שעולות משדות הלב העובריים הראשונים ושני 1. מן הבלסטוציסט לאחר הפרית שלב א 'עד בצורת הלב, תאים עובריים יש אפוא לקבל החלטות תא גורל רבות. שעתוק גנים מוסדר באופן הזמן- ומרחב תלוי הוא תהליך ביולוגי מפתח העומד בבסיס החלטת גורל תא במהלך התפתחות עוברית. תהליך כזה מתווך על ידי גורמי שעתוק ספציפיים המחייבים אזורים רגולטוריים בתוך הגנום כולל משפר ומקדם של גני מכונן לב. DNA הוא כרוך סביב ההיסטונים כי הם נתונים שינויים כגון acetylation, מתילציה, ubiquitinylation, ו / או זרחון. שינוי היסטון מוביל שעתוק גנים מודחק, מופעל או שקול תלוי בו שאריות של היסטון ליזין היא שונות 2.
jove_content "> assay immunoprecipitation הכרומטין (שבב) הוגדר שנים 3 ו משתמשת בטכנולוגיה הנמצא בשימוש הנרחב ביותר כדי לזהות מטרות של היסטונים שונה משני או גורמי שעתוק 4. בעקבות immunoprecipitation של היסטונים או גורמי שעתוק, DNA כבול יכול להיות או מוגבר על ידי תגובת שרשרת פולימרז (PCR) או רצף. שבב שהתגברה טכנית יותר מבחני פיגור ג'ל מאתגר 5. אולם שבב אינה מעידה ישירה מחייב גורם שעתוק ל- DNA, יתרון של assay ג'ל פיגור. מצד שני, שבב בשילוב כדי רצפי DNA פתח פרספקטיבת הגנום כולו חדשה על ויסות גנים.בתאי גזע עובריים (תאי גזע עובריים) שיסכמו בתוך גופי embryoid (כלומר., אגרגטים תא) או בתרבות 2D השלבים המוקדמים של פיתוח לב 6 ולספק חומר עיקרון מספיק שבב. יתר על כן, בתאי גזע עובריים אנושיים מייצגים מודל תאים אנושי של CArdiogenesis למרות הפוטנציאל קרדיוגני שלהם תלויה בחתימה אפיגנטיים שלהם 7. בשלבים מאוחרים יותר של ההתפתחות, רקמות עובריות העכבר לאפשר לחקירת נופים אפיגנטיים ספציפיים הדרושים לצורך קביעת זהות התא. עם זאת, הגנום הוא עבד באופן סוג ספציפי הזמן- ותא 8. תקנה אפיגנטיים של שעתוק הגנים יש להיחקר בתוך אזורים נקודתיים. בזאת, אנו מתארים פרוטוקולים של שבב, שבב רציף ואחריו PCR או רצף באמצעות תאי גזע עובריים, גופי embryoid ואזורים עובריים ספציפיים לב. פרוטוקולים אלה מאפשרים לחקור את הרגולציה אפיגנטיים של שעתוק גני לב.
Protocol
Representative Results
Discussion
אפיגנטיקה הפך תחום חשוב של מחקר בביולוגיה התפתחותית. איך תכנית גנטית מופעלת בתאים עובריים כדי לאפשר לתאי רכישת זהות ספציפית בתוך שושלת עוברית כבר במשך זמן רב שאלת מפתח עבור ביולוגים התפתחותיים.
שבב נעשה שימוש נרחב בתוך בשנים האח…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors acknowledge funding agencies, the IMI StemBANCC European community programme, the leducq Foundation (SHAPEHEART) and the Agence Nationale de la Recherche (Genopath)
Materials
| Formaldehyde | Sigma | F8775 | Cell Fixation |
| Glycine | Sigma | G8898 | Cross-link stop |
| Aprotinin | Fluka | 10820 | Proteases inhibitor |
| Leupeptin hemisulfate | Sigma | L2882 | Proteases inhibitor |
| PMSF | Sigma | P7626 | Proteases inhibitor |
| Protein A magnetic beads | Life technologies | 10001D | Immunoprecipitation |
| SPRI magnetic beads | Thermo Scientific | 15002-01 | DNA purification |
| Proteinase K | Life technologies | 25530-015 | Protein digestion |
| DNA BR standard | Life technologies | Q32850 | Calibration range |
| Syber green | Molecular Probes | S-11484 | DNA quantification |
| TE buffer | Invitrogen | P7589 | DNA quantification |
| PBX 1X | Life technologies | 14190-094 | Washing |
| DNase RNase free water | Life technologies | 10977-035 | Dilution |
| Axygen tube | Axygen | MCT-175-C | ChIP purifiction |
| Antibody | Company | Reference | ChIP concentration |
| H3K27ac | Abcam | ab4729 | 3 µg for ESC and EBs, 1 µg for tissues |
| H3K4me1 | Diagenode | C15410194 (pAb-194-050) | 3 µg for ESC and EBs, 1 µg for tissues |
| H3K36me3 | Diagenode | C15410058 (pAb-058-050) | 3 µg for ESC and EBs, 1 µg for tissues |
| H3K9me2 | Diagenode | C15410060 (pAb-060-050) | 3 µg for ESC and EBs, 1 µg for tissues |
| H3K4me3 | Diagenode | C15410030 (pAb-030-050) | 3 µg for ESC and EBs, 1 µg for tissues |
| H3K27me3 | Diagenode | C15410069 (pAb-069-050) | 3 µg for ESC and EBs, 1 µg for tissues |
References
- Buckingham, M., Meilhac, S., Zaffran, S. Building the mammalian heart from two sources of myocardial cells. Nat Rev Genet. 6, 826-835 (2005).
- Chen, T., Dent, S. Y. Chromatin modifiers and remodellers: regulators of cellular differentiation. Nat Rev Genet. 15, 93-106 (2014).
- Collas, P. The current state of chromatin immunoprecipitation. Mol Biotechnol. 45, 87-100 (2010).
- Gade, P., Kalvakolanu, D. V. Chromatin immunoprecipitation assay as a tool for analyzing transcription factor activity. Methods Mol Biol. 809, 85-104 (2012).
- Scott, V., Clark, A. R., Docherty, K. The gel retardation assay. Methods Mol Biol. 31, 339-347 (1994).
- Van Vliet, P., Wu, S. M., Zaffran, S., Puceat, M. Early cardiac development: a view from stem cells to embryos. Cardiovasc Res. 96, 352-362 (2012).
- Leschik, J., Caron, L., Yang, H., Cowan, C., Puceat, M. A view of bivalent epigenetic marks in two human embryonic stem cell lines reveals a different cardiogenic potential. Stem Cells Dev. 24, 384-392 (2015).
- Bonn, S., Zinzen, R. P., Girardot, C., Gustafson, E. H., Perez-Gonzalez, A., Delhomme, N., Ghavi-Helm, Y., Wilczynski, B., Riddell, A., Furlong, E. E. Tissue-specific analysis of chromatin state identifies temporal signatures of enhancer activity during embryonic development. Nat Genet. 44, 148-156 (2012).
- Kim, T. K., Shiekhattar, R. Architectural and Functional Commonalities between Enhancers and Promoters. Cell. 162, 948-959 (2015).
- Abboud, N., Moore-Morris, T., Hiriart, E., Yang, H., Bezerra, H., Gualazzi, M. G., Stefanovic, S., Guenantin, A. C., Evans, S. M., Puceat, M. A cohesin-OCT4 complex mediates Sox enhancers to prime an early embryonic lineage. Nat Commun. 6, 6749 (2015).
- Dahl, J. A., Collas, P. Q2ChIP, a quick and quantitative chromatin immunoprecipitation assay, unravels epigenetic dynamics of developmentally regulated genes in human carcinoma cells. Stem Cells. 25, 1037-1046 (2007).
- Bernstein, B. E., Mikkelsen, T. S., Xie, X., Kamal, M., Huebert, D. J., Cuff, J., Fry, B., Meissner, A., Wernig, M., Plath, K., et al. A bivalent chromatin structure marks key developmental genes in embryonic stem cells. Cell. 125, 315-326 (2006).
- Wamstad, J. A., Alexander, J. M., Truty, R. M., Shrikumar, A., Li, F., Eilertson, K. E., Ding, H., Wylie, J. N., Pico, A. R., Capra, J. A., et al. Dynamic and coordinated epigenetic regulation of developmental transitions in the cardiac lineage. Cell. 151, 206-220 (2012).
- Stergachis, A. B., Neph, S., Reynolds, A., Humbert, R., Miller, B., Paige, S. L., Vernot, B., Cheng, J. B., Thurman, R. E., Sandstrom, R., et al. Developmental fate and cellular maturity encoded in human regulatory DNA landscapes. Cell. 154, 888-903 (2013).
- Brind’Amour, J., Liu, S., Hudson, M., Chen, C., Karimi, M. M., Lorincz, M. C. An ultra-low-input native ChIP-seq protocol for genome-wide profiling of rare cell populations. Nat Commun. 6, 6033 (2015).
